摘要
目的： 为深入开展胡黄连及其中药新药胡黄连软胶囊的研究开发，针对《中国药典》2020年版胡黄连药材显微鉴别、薄层色谱的不足。本研究选用来自西藏和尼泊尔两个地区采集的15批胡黄连药材为研究对象，利用LC-MS技术对胡黄连成分进行分析研究，确定化学成分组成，结合网络药理学和分子对接技术预测胡黄连质量标志物并进行药理实验验证;对胡黄连药材进行质量标准提升研究，对胡黄连药材显微鉴别和薄层鉴别的鉴别方式进行优化;建立胡黄连药材HPLC指纹图谱及多指标含量测定方法，采用多元统计分析法分析胡黄连药材的差异成分。 方法：1.采用高分辨超高液相色谱-静电轨道阱质谱(UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS)技术对胡黄连甲醇提取物进行定性分析，分析胡黄连中的化学成分，通过参考Pubchem、Chemicalbook等数据库和PubMed、CNKI中的相关文献中所出现的分子式，化合物结构，相对分子量和主要二级碎片离子，使用Thermo Xcalibur4.2.47软件对胡黄连药材液质联用的实验数据进行了分析和鉴定，并采集在正负离子模式下的总离子流图，对化学成分进行鉴定，确定化合物。 2.基于上述液质联用对胡黄连的成分分析研究，初步筛选含量较高的化合物，结合网络药理学方法，分析胡黄连治疗疾病的靶点肝炎，构建出“胡黄连质量标志物成分-靶点-通路”图，系统的预测胡黄连的质量标志物，然后采用分子对接进行验证，通过体外药理实验评价胡黄连提取物及胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅳ、6-阿魏酰梓醇、车前草苷D和米内苷对油酸刺激hepG2细胞形成脂滴并产生的非酒精性脂肪肝炎的药理作用，并设立低、中、高三个剂量，进一步通过TNF-α和IL-6试剂盒进一步评价胡黄连提取物及各对照品对非酒精性脂肪肝炎的作用效果。 3.胡黄连质量标准研究：显微鉴别中使用水合氯醛溶液对胡黄连药材粉末进行透化，置于显微镜下观察;胡黄连薄层鉴别中增加胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ对照品，选择硅胶GF254薄层板，展开剂为三氯甲烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸(2∶4∶2∶1);按《中国药典》2020年版中的方法对胡黄连药材进行常规检查和含量测定。 4.采用了 HPLC法建立胡黄连药材的指纹图谱，优化了洗脱梯度，色谱条件等,对指纹图谱相似度评价，并结合主成分分析和聚类分析对胡黄连药材进行评价。以建立胡黄连药材的HPLC指纹图谱的方法建立了胡黄连药材多指标含量测定的分析方法，分析了来自不同产地的15批胡黄连药材，同时测定了胡黄连药材中6个主要活性成分的含量。 结果：1.胡黄连甲醇提取物中经分析鉴定得到25个化合物。其中包括：环烯醚萜苷类10个、苯乙醇苷类3个、酚苷类5个和其他类成分7个。 2.结合网络药理学与分子对接内容预测出7个质量标志物，分别为胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅳ、6-阿魏酰梓醇、车前草苷D和米内苷。药理实验的结果表明，胡黄连各对照品及胡黄连提取物对非酒精性脂肪肝炎体外模型有较好的药理活性，设置的胡黄连提取物及各对照品的低、中、高三个剂量结合TNF-α和IL-6 试剂盒等结果发现，其中胡黄连苷Ⅱ的作用效果较为明显，米内苷和6-阿魏酰梓醇的效果一般，并与剂量呈现出一定的相关性。 3.对胡黄连药材进行了显微鉴别，发现胡黄连药材的主要显微特征有木栓细胞、薄壁细胞、导管主要包含螺纹导管和网纹导管，其中以螺纹导管为主、棕色块等，加热升华后，置于显微镜下观察，可见针状、针簇状结晶。薄层鉴别结果显示，胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的分离度较好，15批胡黄连均和对照药材有在相同Rf值下有相同颜色、形状和大小的斑点。检查项中15批胡黄连药材的水分含量在6.80％～12.79％之间，平均值为9.84％,醇溶性浸出物含量在34.54％～39.86％之间，平均值为36.99％,总灰分含量在3.42％～5.1％之间，平均值为4.07％,酸不溶性灰分在0.85％～1.11％之间，平均值为0.98％,结果表明15批胡黄连药材水分、醇溶性浸出物含量、总灰分和酸不溶性灰分均符合要求。含量测定结果显示除第四批外，其余14批胡黄连药材样品中的胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的总量均在9％以上，符合要求。 4.由相似度评价结果可知，除第二批与其余几批相差较大，其余胡黄连药材与对照图谱的相似度结果均在0.93以上，建立的指纹图谱共标定18个共有峰;指认了其中6个色谱峰，分别为胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅳ、6-阿魏酰梓醇和米内苷6个成分，聚类分析(CA)与主成分分析(PCA)结果显示，15批样品经聚类分析可分为3类，PCA将胡黄连药材分为3类，与CA结果一致。对胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅳ、6-阿魏酰梓醇和米内苷6个成分进行了含量测定，含量分别为(29.90～74.20、42.34～90.46、2.61～7.24、3.65～6.34、4.52～12.11、3.33～7.02)mg/g,实验发现15批胡黄连药材样品中除S4外，其余胡黄连药材样品中的胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的总量均符合《中国药典》2020版中要求。 结论：本研究采用液质联用技术对胡黄连药材中的成分进行分析，并结合网络药理学、分子对接和药理学实验对胡黄连质量标志物进行预测并验证，发现胡黄连中的主要活性成分对非酒精性脂肪性肝炎体外模型有较好的药理活性，其中以胡黄连苷Ⅱ的作用效果较为明显，米内苷与6-阿魏酰梓醇的效果一般，并与剂量呈现出一定的相关性。其次对胡黄连药材质量标准进行了提升和优化，对胡黄连药材的显微鉴别和薄层色谱鉴别方法进行补充研究，结果表明该薄层鉴别方法对胡黄连的中的胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ分离鉴别效果较好，有较强的专属性，有良好的重现性，药材样品用量少，方法简便，鉴别效率高，可以准确的鉴别出胡黄连药材，可用来对胡黄连药材进行薄层鉴别，弥补了现有质量标准的不足。建立了新的指纹图谱和多指标含量测定方法，本研究建立的指纹图谱和多指标含量测定方法重复性好、结果可靠，可为胡黄连药材的质量控制提供的参考，为胡黄连质量控制提供一种更全面、科学的评价方法。
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