摘要
目的: 观察通窍活血汤对星形胶质细胞氧糖剥夺复氧损伤（OGD/R）的保护作用，并基于星形胶质细胞的谷氨酸代谢探讨其作用机制。 实验一 通窍活血汤对星形胶质细胞OGD/R损伤后GS的保护作用 方法: 选用孕17-18d Sprague-Dawley（SD）大鼠，提取胎鼠原代星形胶质细胞并鉴定其纯度，随机分为对照（Control）组、氧糖剥夺复氧损伤（OGD/R）组、通窍活血汤（THD）组、蛋白酶体抑制剂（MG132）组、蛋白酶体抑制剂+通窍活血汤（MG132+THD）组、溶剂对照（DMSO）组。通过CCK-8试剂盒检测细胞活力进行造模时间及用药剂量的筛选。各组细胞以相应条件干预后24h进行指标检测:比色法检测细胞内谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）的浓度变化;免疫荧光技术检测谷氨酸胺合成酶（Glutamine Synthetase，GS）及蛋白酶体20S在细胞内的表达;Western blotting检测星形胶质细胞中20S、GS的蛋白表达。 结果: 1.根据在不同氧糖剥夺复氧条件下CCK-8检测的星形胶质细胞活力情况，选定细胞存活率接近50％的OGD/R时间为最佳造模时间，即氧糖剥夺6h复氧24h。 2.根据不同浓度含药血清对OGD/R损伤后星形胶质细胞活力影响的CCK-8检测结果，选定无毒性且药效最佳的5％含药血清为THD治疗浓度。 3.通窍活血汤对星形胶质细胞OGD/R损伤后Glu、Gln浓度的影响:与Control组相比，OGD/R组Glu浓度明显降低（P＜0.01）;与OGD/R组相比，THD组、MG132组、MG132+THD组Glu浓度均明显升高（P＜0.01），各治疗组之间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与Control组相比，OGD/R组Gln浓度明显降低（P＜0.01）;与 OGD/R 组相比，THD 组、MG132 组、MG132+THD组Gln浓度均升高（P＜0.05）,各治疗组之间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 4.通窍活血汤对星形胶质细胞OGD/R损伤后GS和20S蛋白表达的影响: （1）免疫荧光结果显示:与Control组相比，OGD/R组GS荧光强度明显降低（P＜0.01）;与 OGD/R 组相比，THD 组、MG132 组、MG132+THD 组 GS的荧光强度均明显升高（P＜0.01）;与THD组相比，MG132组、MG132+THD组GS的荧光强度均升高（P＜0.05）。与Control组相比，OGD/R组20S荧光强度升高（P＜0.05）;与 OGD/R 组相比，THD 组、MG132 组、MG132+THD 组20S的荧光强度降低（P＜0.01或P＜0.05），各治疗组之间两两比较差异无统计学意义(P＞0.05）。 （2）Western blotting结果显示:与Control组相比，OGD/R组GS蛋白表达量减少（P＜0.05）;与OGD/R组相比，THD组、MG132组、MG132+THD组GS蛋白表达量明显上升（P＜0.01）;各治疗组之间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与Control组相比，OGD/R组20S蛋白表达量明显升高（P＜0.01）;与OGD/R组相比，THD组、MG132组、MG132+THD组20S蛋白表达量均下降（P＜0.05或P＜0.01）;与THD组相比，MG132组、MG132+THD组均下降（P＜0.05 或 P＜0.01）。 实验二 通窍活血汤调控线粒体呼吸链影响星形胶质细胞OGD/R损伤后GS蛋白酶体降解的机制研究 方法: 选用孕17-18d Sprague-Dawley（SD）大鼠，提取胎鼠原代星形胶质细胞并鉴定其纯度，随机分为对照（Control）组、氧糖剥夺复氧损伤（OGD/R）组、通窍活血汤（THD）组，以细胞能量代谢分析系统检测各组细胞线粒体基础呼吸能力、线粒体复合体Ⅰ、Ⅱ的功能活性以及ATP的产生能力，以观察通窍活血汤对星形胶质细胞OGD/R损伤后线粒体呼吸链的影响。 另取原代星形胶质细胞，随机分为对照（Control）组、氧糖剥夺复氧损伤（OGD/R）组、通窍活血汤（THD）组、线粒体复合体Ⅰ Ⅱ抑制剂鱼藤酮与寡霉素（Rot+Omy）组、线粒体复合体Ⅰ Ⅱ抑制剂鱼藤酮与寡霉素+通窍活血汤（Rot+Omy+THD）组、溶剂对照（DMSO）组，以ROS荧光探针检测各组细胞ROS的含量，免疫荧光技术检测各组细胞20S的蛋白表达以探讨通窍活血汤通过调控线粒体呼吸链影响星形胶质细胞OGD/R损伤后ROS的产生，从而抑制蛋白酶体20S表达以减少GS降解的作用机制。 结果: 1.细胞能量代谢分析系统检测结果显示:与Control组相比，OGD/R组基础呼吸量、线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ的功能活性及ATP产能均明显降低（P＜0.01）;与OGD/R组相比，THD组基础呼吸量、线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ的功能活性及ATP产能明显升高（P＜0.01）。 2.ROS荧光探针结果显示:与Control组相比，OGD/R组ROS含量明显升高（P＜0.01）;与OGD/R组相比，THD组ROS含量明显降低（P＜0.01）,Rot+Omy组ROS含量明显升高（P＜0.01），Rot+Omy+THD组ROS含量无显著性差异（P＞0.05）;与 THD 组相比，Rot+Omy 组及 Rot+Omy+THD 组 ROS 含量明显升高（P＜0.01）。 3.免疫荧光结果显示:与Control组相比，OGD/R组20S荧光强度升高（P＜0.01）;与OGD/R组相比，THD组20S荧光强度明显降低（P＜0.01），Rot+Omy组20S荧光强度明显升高（P＜0.01）,Rot+Omy+THD组20S荧光强度无显著性差异（P＞0.05）;与THD组相比，Rot+Omy组及Rot+Omy+THD组20S荧光强度均明显升高（P＜0.01）。与Control组相比,OGD/R组GS荧光强度降低（P＜0.01）;与OGD/R组相比，THD组GS荧光强度明显升高（P＜0.01），Rot+Omy组GS荧光强度明显降低（P＜0.05），Rot+Omy+THD组GS荧光强度无显著性差异（P＞0.05）;与THD组相比，Rot+Omy组及Rot+Omy+THD组GS荧光强度均明显降低（P＜0.01）。 结论: 1.星形胶质细胞OGD/R损伤后，细胞内Glu代谢关键酶GS的蛋白表达减少，Glu、Gln含量降低，蛋白酶体20S表达增多。通窍活血汤可明显提高细胞内Glu、Gln浓度及GS的蛋白表达，同时降低蛋白酶体20S的蛋白表达，且其作用受蛋白酶体抑制剂的影响，说明THD通过调控Glu代谢发挥对星形胶质细胞OGD/R损伤的保护作用，且这一作用与抑制蛋白酶体20S对GS的降解有关。 2.星形胶质细胞OGD/R损伤后，线粒体呼吸功能受损，ROS增多。通窍活血汤可增强其线粒体呼吸功能，提高基础呼吸量和线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ的活性，减少ROS的产生，保护GS免受蛋白酶体20S的降解，从而改善OGD/R损伤后星形胶质细胞内的Glu代谢，对抗Glu兴奋性毒性以发挥脑保护作用。
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