摘要
目的:通过“祛斑紧皱”精华液体外药效实验进一步证实精华液治疗效果，同时根据精华液药物组成种的阐明祛斑精华液的药效有效成分来验证黄褐斑模型大鼠透皮给药的药效及部分作用机制，为中医外治与辨病论治黄褐斑奠定坚实的理论和实验基础。方法:①理论探讨:通过中国知网、万方数据、Pubmed等搜索黄褐斑、病因病机、辨病论治等系统梳理中医和西医关于黄褐斑的认识和治疗方法，可以更好地把握研究的前沿。同时，总结研究进展的同时也要警惕当前存在的问题并提出解决方案。 ②细胞模型实验:采用α-MSH诱导B16F10小鼠黑色素瘤细胞制备黑色素高表达模型细胞，采用MTT检测细胞活性、NaOH裂解法检测B16F10细胞黑色素含量、L-DOPA氧化速率法测定B16F10细胞酪氨酸酶活性、ELisa试剂盒检测SOD、TYR活性及MDA、TNF-α、GSH-Px 含量。 ③动物模型实验:采用紫外线照射（波长为280～320 nm）联合左右后腿交替注射黄体酮（7.5mg/kg）42天的方法制备黄褐斑模型大鼠，通过“祛斑紧皱”精华液有效成分透皮给药治疗黄褐斑模型大鼠，验证“祛斑紧皱”精华液有效成分治疗黄褐斑的药效及作用机制。本研究选用SD雌性大鼠作为黄褐斑疾病模型，分为正常组（Z）、模型组（M）、美白祛斑霜阳性药对照组（Y）、“祛斑紧皱”精华液组（Q）、“祛斑紧皱”精华液有效成分低（HD）（丹皮酚150mg/kg、黄芩苷25mg/kg、熊果苷25mg/kg、杏仁酸70mg/kg）、中（HZ）（丹皮酚300mg/kg、黄芩苷50mg/kg、熊果苷50mg/kg、杏仁酸 140mg/kg）、高（HG）（丹皮酚 450mg/kg、黄芩苷 75mg/kg、熊果苷 75mg/kg、杏仁酸210mg/kg）剂量组，造模期间同时将药物（2ml）涂抹大鼠后背裸露皮肤给药42天后，大鼠取材取皮肤、血清，采用Elisa法检测黄褐斑大鼠皮肤、血清内SOD活度是否升高及TYR活度，MDA、TNF-α、GSH-Px含量是否降低，转录组测序筛选差异基因。 结果:①目前治疗黄褐斑的方法在中西医结合的过程中各有优劣。中药外治虽然有效，但见效缓慢且剂型不够成熟;而西医治疗虽然快速有效，但副作用明显，易复发并可能危害健康。因此急需一种安全、有效、剂型成熟的中药透皮给药制剂来祛斑，而“祛斑紧皱”精华液在临床应用中表现出显著疗效，值得进一步研究。 ②经给予“祛斑紧皱”精华液应用于α-MSH诱导B16F10小鼠黑色素瘤细胞后，与细胞对照组相比，B16F10细胞中黑色素含量明显降低、细胞中酪氨酸酶活性明显降低、B16F10模型组细胞中SOD活性明显降低、MDA水平明显升高。与模型组相比，α-促黑素组+祛斑0.625、1.25、2.5、5mg/ml"组SOD活性均显著升高，MDA水平明显降低。 ③经给予“祛斑紧皱”精华液有效成分造模结束后，与空白组大鼠相比，M组大鼠皮肤与血清中TYR活性、MDA、TNF-α、GSH-Px含量显著升高（P＜0.0001），SOD活性显著降低（P＜0.0001）。与M组相比，各给药组大鼠皮肤与血清中TYR活性与MDA、TNF-α、GSH-Px 含量显著降低（P＜0.0001，P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05），SOD活性显著升高（P＜0.0001，P＜0.05）。 ④通过对三组大鼠进行皮肤组织转录组测序，在Z组与M组对比时发现，皮肤组织中显著上调及下调差异表达基因分别为271个和184个，在M组与HZ组对比时发现，显著上调及下调差异表达基因分别为162个和115个，表明在外用“祛斑紧皱”精华液有效成分后皮肤组织中基因表达发生显著的变化;通过大鼠背部皮肤KEGG通路富集发现其显著富集在补体和凝血级联反应、氨基酸的生物合成、神经活性配体-受体相互作用、癌症中的转录失调、肌动蛋白细胞骨架的调节等。 结论:①系统梳理了中医和西医对黄褐斑的认识和治疗方法，指出了中西医结合治疗黄褐斑的优劣，总结了当前治疗黄褐斑存在的问题，如中药外治见效缓慢、剂型不成熟，西医治疗副作用明显、易复发，提出了中医外治法的优势，包括通过辨证施治以及直接对黄褐斑病变位置的刺激来调和气血阴阳，改善局部血液循环。 ②确认“祛斑紧皱”精华液在体外对α-MSH诱导的B16F10小鼠黑色素瘤细胞模型具有显著的降低黑色素含量、酪氨酸酶活性和提高SOD活性的作用。 ③验证“祛斑紧皱”精华液有效成分通过透皮给药方式在黄褐斑模型大鼠中显著提高SOD活性、降低TYR活性、MDA、TNF-α、GSH-Px含量，表明其具有提高皮肤抗氧化能力和降低黑色素生成的效果。 ④转录组测序结果表明“祛斑紧皱”精华液有效成分能够引起皮肤组织中基因表达的显著变化，这可能与其药效机制有关。 ⑤综合以上研究结果，可以认为“祛斑紧皱”精华液通过抑制黑色素生成和抗氧化作用，在一定程度上具有治疗黄褐斑的效果。
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