摘要
肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）是奶牛乳腺炎常见病原菌之一，其毒力因子铁载体与铁代谢密切相关。硒参与 GPX4 的合成并维持其活性状态，保护细胞免受氧化应激的损害。铁死亡是一种细胞程序性死亡模式，其启动途径为铁过度积累和 SLC7A11-GSH-GPX4抗氧化系统的抑制。硒能调控K. pneumoniae所致的氧化损伤和炎性反应，但尚无报道阐明K. pneumoniae诱导的奶牛乳腺炎中对铁死亡的调控作用。本试验通过K. pneumoniae感染奶牛乳腺上皮细胞（Bovine mammary epithelial cells, BMECs）构建体外炎症模型，探究K. pneumoniae诱导的炎性反应与铁死亡的联系；通过添加硒，探究硒的调控机理。总结如下： 1. 肺炎克雷伯菌感染对奶牛乳腺上皮细胞铁死亡及炎性反应的影响 为评估K. pneumoniae对BMECs炎性反应与铁死亡的影响，将K. pneumoniae以MOI=10:1感染细胞。通过平板计数法检测细菌黏附能力；检测LDH水平来评估细胞的损伤程度；同时检测铁死亡关键蛋白SLC7A11、GPX4、PTGS2蛋白表达水平和GSH-Px水平；MDA评估脂质过氧化水平；NF-κB信号通路关键蛋白磷酸化水平、p65核转位和炎性因子 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α mRNA 水平评估炎性反应。结果显示 K. pneumoniae侵袭BMECs后，K. pneumoniae的黏附能力极显著增强（plt;0.01），LDH水平显著升高（plt;0.05或plt;0.01）；K. pneumoniae侵袭后细胞内GSH-Px水平显著降低（plt;0.05或plt;0.01），细胞代谢产生的MDA水平显著升高（plt;0.05或plt;0.01），PTGS2蛋白表达水平在感染4 h后极显著升高，SLC7A11和GPX4蛋白表达水平在感染4 h时极显著降低（plt;0.01）；p65和IκB蛋白磷酸化水平显著升高（plt;0.05或plt;0.01），并同时促进p65蛋白发生核转位，IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的基因表达水平均显著升高（plt;0.05或plt;0.01）。基于以上结果推测K. pneumoniae侵袭BMECs通过激活NF-κB信号通路，上调炎性因子表达，诱导炎性损伤；同时，BMECs内SLC7A11-GSH-GPX4抗氧化系统被抑制，诱发铁死亡。 2. 调控细胞铁死亡对肺炎克雷伯菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性反应的影响 为进一步确认铁死亡能否调节由K. pneumoniae所导致的BMECs的损伤，本试验中使用 Ferrostain-1 抑制铁死亡。设立空白对照组，Ferrostatin-1（10 μmol/L）组，K. pneumoniae组，K. pneumoniae+Ferrostatin-1（10μmol/L）组。检测细菌黏附能力、GSH-Px和MDA水平、铁死亡关键蛋白和NF-κB信号通路关键蛋白表达水平、p65蛋白核转位和细胞因子mRNA水平。结果显示，与K. pneumoniae组相比，Ferrostatin-1极显著上调GSH-Px水平和SLC7A11、GPX4蛋白表达水平（plt;0.01），同时下调MDA水平和PTGS2蛋白表达水平（plt;0.01）；通过Ferrostatin-1抑制铁死亡后，与K. pneumoniae组相比，K. pneumoniae 对 BMECs 的黏附能力无显著影响，LDH 水平极显著升高（plt;0.01），IκB-α 和 p65 的磷酸化水平显著降低（plt;0.05 或 plt;0.01），同时逆转 K. pneumoniae所致的p65蛋白核转位，IL-1β、IL-8 mRNA表达水平降低。基于以上结果推测Ferrostatin-1能抑制K. pneumoniae诱导的BMECs的铁死亡；通过Ferrostatin-1抑制铁死亡后，调控K. pneumoniae诱导BMECs的NF-κB信号通路介导的炎性反应，缓解细胞损伤。 3. 硒对肺炎克雷伯菌感染奶牛乳腺上皮细胞铁死亡及炎性反应的影响 为研究Se-Met对BMECs铁死亡和炎性反应的影响，本试验对细胞进行如下处理：对照组，Se-Met（4μmol/L）组、K. pneumoniae组和K. pneumoniae+Se-Met（4μmol/L）组。检测GSH-Px和MDA水平、铁死亡关键蛋白和NF-κB信号通路关键蛋白表达水平、p65蛋白核转位和细胞因子mRNA水平。结果显示，与K. pneumoniae组相比，Se-Met预处理极显著降低LDH水平（plt;0.01）；Se-Met能极显著升高细胞内GSH-Px水平和GPX4蛋白表达水平（plt;0.01）；与K. pneumoniae组相比，K. pneumoniae+Se-Met（4μmol/L）组的GSH-Px水平和SLC7A11、GPX4蛋白表达水平极显著升高（plt;0.01）， MDA水平和PTGS2蛋白表达水平极显著降低（plt;0.01）；Se-Met预处理后IκB-α和p65的磷酸化水平均显著降低（plt;0.05），并一定程度上逆转了p65蛋白核转位，IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平显著下降（plt;0.05或plt;0.01）。基于以上结果推测补硒通过上调GPX4水平激活SLC7A11-GSH-GPX4抗氧化系统，缓解K. pneumoniae感染所致铁死亡，以缓解BMECs的炎性损伤。 综上所述，K. pneumoniae诱导BMCEs发生铁死亡；通过调控铁死亡后，NF-κB信号通路被抑制，缓解细胞的炎性损伤。Se-Met可以通过激活SLC7A11-GSH-GPX4抗氧化系统调控铁死亡，从而缓解细胞的炎性损伤。
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