摘要
目的:探讨积雪草对狼疮模型MRL/lpr小鼠的治疗作用。通过网络药理学分析结合动物实验及分子细胞学实验探讨积雪草及其活性化合物积雪草苷、羟基积雪草苷对TLR4通路的调控作用，阐释积雪草治疗SLE的作用机制。 方法:1.积雪草成分分析及网络药理学分析:制备积雪草水煎剂样品，采用质谱分析鉴定积雪草的化学成分，并通过TCMSP、文献报道及质谱鉴定结果确定积雪草的活性化合物。运用中药系统药理学技术平台（TCMSP）、Swiss Target Prediction以及Pharm Mapper服务器挖掘积雪草活性化合物成分的潜在靶点。通过GEO数据库以及6个在线疾病靶点数据库搜集SLE疾病靶点。再将药物靶点与疾病靶点取交集，获得积雪草防治SLE的可能作用靶点，再将其进行PPI网络分析、KEGG通路分析和GO功能分析，并筛选出核心靶点。根据通路分析结果选取相关靶点与积雪草活性化合物进行分子对接，获得其亲和力，再根据亲和力大小筛选出两个结合性最强的活性化合物进行后续实验。 2.动物学实验:以MRL/lpr狼疮小鼠为研究动物。分两批进行实验，第一批以C57BL/6小鼠作为空白对照，将MRL/lpr狼疮小鼠分为模型组（M组），醋酸泼尼松组（PAT 组,4.55mg/kg·d）、积雪草组（J 组，30mg/kg·d）,每组 6 只。第二批以 C57BL/6小鼠作为空白对照，将MRL/lpr狼疮小鼠分为模型组（M组），醋酸泼尼松组（PAT组，4.55mg/kg·d）、积雪草苷组(AS组，20mg/kg·d）每组5只。干预结束后，检测各组小鼠的脾脏胸腺指数，血常规指标，血清细胞因子，外周血ANA、抗dsDNA、snRNP/Sm抗体，肾脏病理变化，肾组织抗体复合物沉积变化等，探讨积雪草水煎剂及积雪草苷对狼疮模型小鼠的治疗效应及机制。 3.细胞学实验:以293T细胞与HK-2人肾小管上皮细胞为研究对象，通过CCK8实验确定给药浓度，双荧光素酶报告基因实验检测它们对NF-κB转录活性及IL6启动子区域的荧光素酶活性的调控，RT-PCR和免疫荧光检测TRL4、NF-κB、Myd88等基因和蛋白的表达。同时检测ROS、JC-I和TOMM20等线粒体相关指标，探讨积雪草及其活性化合物积雪草苷、羟基积雪草苷对HK-2细胞线粒体功能的影响。 结果:1.采用UPLC-Q/TOF-MS对积雪草中所含化学成分进行鉴定和分析，在负离子模式下鉴定出36个化合物，在正离子模式下鉴定出41个化合物。鉴定出的化合物涵盖了文献报道的化学成分，表明积雪草水煎剂质量稳定。通过于TCMSP及文献报道对比，筛选出14个积雪草主要活性化合物进行后续研究。而后利用网络药理学预测了372个积雪草干预SLE的可能靶点，这些靶点的富集分析主要集中在炎症和氧化应激方面，结合核心靶点，选择TLR4、NF-κB、Myd88、IL-6四个蛋白与各活性成分进行分子对接，发现积雪草苷与羟基积雪草苷与这四种蛋白结合力最强。 2.动物学实验中，与模型组相比，各给药组均可降低MRL/lpr狼疮小鼠脾脏、胸腺指数，减少淋巴细胞、中性粒细胞和白细胞计数，降低血清细胞因子水平、，改善肾脏组织的病理改变。ELISA结果显示，MRL/lpr模型组小鼠外周血中IL-6、IFN-γ、TNF-α细胞因子水平均显著升高，各给药组均降低了他们的表达，同时积雪草苷（AS）组IL-1β的表达也受到抑制。外周血中ANA、抗dsDNA、snRNP/Sm抗体水平减少。减轻MRL/lpr狼疮模型鼠的肾脏损害，减少IgG抗体复合物在肾脏组织中的沉积，显著降低尿蛋白含量。RT-PCR结果表明积雪草及积雪草苷（AS）能够抑制MRL/lpr小鼠肾组织中TLR4、NF-κB、Myd88和IL-6mRNA的含量。组织免疫荧光结果表明积雪草及积雪草苷（AS）抑制了 MRL/lpr小鼠肾组织TLR4和Myd88蛋白表达。 3.细胞学实验中，双荧光素酶报告基因结果显示积雪草及积雪草苷（AS）、羟基积雪草苷（MS）均能显著抑制NF-κB以及IL-6启动子区域的转录活力，说明积雪草、AS和MS抑制了 NF-κB的活化以及通过抑制IL-6启动子的活性，导致IL-6基因的转录和表达水平降低，从而减轻炎症反应。RT-PCR结果表明积雪草及积雪草苷（AS）、羟基积雪草苷（MS）抑制HK-2细胞内TLR4、NF-κB、Myd88和IL-6mRNA的表达。对HK-2细胞进行免疫荧光染色，结果显示积雪草及积雪草苷（AS）、羟基积雪草苷（MS）能够抑制HK-2细胞内TLR4和Myd88蛋白的表达。对HK-2细胞进行ROS检测，结果显示积雪草及积雪草苷（AS）、羟基积雪草苷（MS）均能显著抑制ROS的生成，同时也能恢复H2O2导致的线粒体膜电位下降以及LPS导致的线粒体断裂。 结论:1.质谱分析鉴定积雪草在正离子模式下归属化合物41个，负离子模式下36个。通过网络药理学预测积雪草可能通过调控炎症、氧化应激相关通路在SLE的治疗中发挥作用。 2.积雪草水煎剂及积雪草苷能够有效控制MRL/lpr狼疮模型鼠病情发展，可以有效抑制炎性细胞因子的分泌，降低血清多种自身抗体的含量，减轻肾脏中IgG的沉积和TLR4、Myd88蛋白的表达，减少尿蛋白含量，同时积雪草苷还可以降低尿素氮，进而改善肾脏病理损伤。进一步通过RT-PCR实验证明积雪草或积雪草苷均可降低肾脏中 TLR4、Myd88、NF-κB 和IL-6mRNA 水平。 3.积雪草、积雪草苷、羟基积雪草苷可以减少NF-κB以及IL-6启动子区域的转录活力，从而抑制NF-κB及IL-6基因的转录和表达。对HK-2细胞的TLR4和Myd88的mRNA以及蛋白的表达均表现出显著的抑制作用，同时也可抑制NF-κB和IL-6mRNA的转录。积雪草、积雪草苷、羟基积雪草苷对ROS都有不同程度的抑制作用，也可恢复H2O2导致的线粒体膜电位的下降同时也减少了 LPS刺激引起的线粒体断裂现象。
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