摘要
以婴幼儿配方奶粉（PIF）为主的婴幼儿食品是母乳的重要替代品。婴幼儿群体免疫系统弱且对细菌感染较为敏感。因此，对以 PIF 为主的婴幼儿食品中微生物污染进行研究尤为必要。其中，以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）为典型的成芽孢类细菌能耐受高温处理、原位清洗等工业消杀步骤，且能在 PIF 加工过程中形成生物被膜并作为持续性微生物污染源引起食源性疾病传播、乳品腐败变质、乳品加工设备损耗及企业能耗增加等诸多棘手问题。 本研究拟采用传统分离培养法结合高通量测序技术对扬州地区市售22份婴幼儿辅食产品（19份PIF和3份谷类辅食）进行微生物生态多样性解析。同时，基于细菌生物被膜形成的新视角探究典型成芽孢细菌对 PIF 生产的潜在危害，借助电子显微镜观察、全基因组测序、转录组学分析等多手段，全面分析 B. licheniformis 生物被膜形成规律以及钙离子（Ca2+）对其生物被膜形成的调控机制；最后，探究有机过氧酸作为新型、高效的B. licheniformis生物被膜清除剂的可能性。具体研究内容如下： （1）基于传统分离培养法发现，婴幼儿食品中的细菌菌群由15个属、41个种构成。其中 在 170 株 分 离 株 中 ，Bacillus（77.6%）、Paenibacillus（7.06%） 和Alkalihalobacillus（3.53%）为优势菌属，而在种水平上的优势菌种为 B. licheniformis （49.41%）、B. subtilis（10.59%）和B. pumilus（5.88%）等。基于RAPD-PCR指纹图谱分析发现 B. licheniformis 共有六个不同的基因型，表明其种内遗传多样性。对优势菌种 B. licheniformis 分离株进行耐药实验，发现所有分离株均对四环素、哌拉西林、万古霉素敏感，而 1.56%的 B. licheniformis 菌株对红霉素耐药。与传统分离培养法相比，高通量测序技术检测到的微生物多样性在属水平和种水平分别提高 18和 42倍。其 中 ， 主 要 优 势 菌 属 为 Lactococcus（25.36%）、Streptococcus（22.06%）、Bifidobacterium（6.37%）、Chloroplast（6.31%）和 Geobacillus（4.67%），而优势菌种为 Lactococcus lactis、Bifidobacterium animalis、Geobacillus stearothermophilus、Lactococcus piscium和Lactobacillus delbrueckii。 （2）采用结晶紫染色法对分离到的 64株 B. licheniformis进行生物被膜形成能力测定，结果发现，分别有56、4和4株B. licheniformis具有强、中和弱生物被膜形成能力，同时，具有相同RAPD指纹图谱的B. licheniformis生物被膜形成能力存在种内异质性。进一步选取四株B. licheniformis（BL215、BL325、BL919和BL131）进行生物被膜形成异质性分析，结果发现，这四株菌在不锈钢片表面成膜能力（牛奶培养基中：3.37-4.04 Log CFU/cm2；TSB培养基中：5.18-5.94 Log CFU/cm2）、运动能力（泳动能力：2.46-5.55 cm；群集能力：3.31-5.71 cm）、EPS 组成（多糖含量：7.51-10.07μg/mL；蛋白质含量：38.28-98.34 ?g/mL）、生物被膜空间结构特征（覆盖率：16.4-55.3%；平均厚度：10.6-60.2μm）均差异显著。进一步利用全基因组测序结合重测序技术分析发现，这四株菌的基因组组成差异显著，且双组分系统、ABC转运蛋白、群体感应、淀粉和蔗糖代谢、嘌呤代谢、乙醛酸和二羧酸代谢以及磷酸转移酶系统等代谢途径是参与B. licheniformis生物被膜形成的重要途径。 （3）挑选BL2-8、BL2-11、BL2-13和 BL3-24作为目标菌株，分别以 96孔板及不锈钢片为模型探究Ca2+对这四株B. licheniformis菌株生物被膜形成的调控作用。结果发现，Ca2+对 B. licheniformis 的生长作用无显著影响，但能显著促进其生物被膜的形成，且调控作用呈现出明显的剂量依赖性。通过测定生物被膜相关表型发现，Ca2+对B. licheniformis泳动和群集能力有显著促进作用，而高浓度Ca2+（20 mM）对其群集能力表现出抑制作用。同时，随着Ca2+浓度的增加，EPS中蛋白质/多糖含量的比值显著增加，且生物被膜结构变得更加复杂。进一步通过转录组学探究10 mM和20 mM Ca2+诱导B. licheniformis BL2-11生物被膜形成的分子机制。结果表明，不同浓度Ca2+对B. licheniformis生物被膜形成的调控机制有差异，分别有939个基因（10 mM）和951 个基因（20 mM）的表达显著发生变化，且差异基因与鞭毛组装、双组分系统、群体感应、ABC转运蛋白以及碳水化合物和氨基酸代谢通路等功能相关。 （4）创建一种基于有机酸与有机过氧酸为消毒剂高效清除B. licheniformis生物被膜的新方法。利用不同有机酸（柠檬酸、苯乳酸、苹果酸和丁酸）及其过氧酸对浮游态 B. licheniformis 及其形成的生物被膜进行清除试验。结果表明，有机过氧酸的清除效果优于有机酸的清除效果，且过氧苯乳酸的清除效果最佳。经过氧苯乳酸处理后的浮游态B. licheniformis细菌菌落数下降4.14 Log CFU/mL；细胞表面疏水性降低，导致其粘附力降低，不锈钢片上生物被膜中残存活细胞数量仅为 2.80 Log CFU/cm2，下降2.50 Log CFU/cm2；不锈钢片上生物被膜厚度减少 53.36%且生物量覆盖率显著降低27.33%。过氧苯乳酸对 B. licheniformis 生物被膜的最低杀菌浓度为 0.125%，即 125 mg/L。在实际生产过程中可节省消毒剂的用量，更加经济环保。
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