摘要
藏橘皮为橘栽培变种藏橘（Citrus reticulata cv. Manau Gan）的干燥成熟果皮，藏橘为柑橘亚属宽皮柑橘。据《得荣年鉴》2021年版载，藏橘在当地已有超过千年的种植历史，在四川省内主要分布在横断山脉南段的三江中下游河谷农牧区的得荣、木里等县，具食药两用的特点，具止咳化痰、开胃健脾、润肠通气等作用。据统计，得荣县藏橘种植面积现已超过1600亩，年产量980吨左右，是得荣县三大特色农产品之一。目前以果用为主，未见对藏橘皮的综合开发利用的报道，基础研究薄弱。但对源于同属植物的柑橘果皮已有大量的文献报道，课题组对陈皮的研究亦表明，柑橘果皮有效成分的种类和含量与采收时间密切相关，适期采收利于更充分利用橘皮资源。藏橘每年10月-次年2月采收，主要于12月中下旬采收，采收时间长达5个月，亟需对不同采收时间藏橘皮化学成分与生物活性进行研究，明确不同采收时间藏橘皮的化学特性和食药用价值，为充分利用藏橘皮资源奠定了基础。 本文采用定产地、定植株的研究方法收集藏橘皮样品（2022年10月至2023年2月，每月釆摘），首次对不同采收时间藏橘皮挥发性成分和非挥发性成分进行定性定量分析，比较研究其动态变化规律；对藏橘皮进行体外抗氧化活性和降脂活性评价，为藏橘皮资源的综合开发利用提供参考。主要研究内容及结果如下： 1.不同采收时间藏橘皮挥发性成分比较研究 已有研究表明，采收时间是影响柑橘挥发性成分组成和含量的重要因素之一，适宜的采收期可提高柑橘挥发性成分的含量。本章实验采用电子鼻和气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）技术比较研究不同采收时间藏橘皮的挥发性成分的变化规律。结果表明，共鉴定出78种挥发性成分，主要由萜类、醇类和醛类等成分组成；不同采收时间藏橘皮中挥发性成分组成一致，但含量变化明显，总体呈现先下降后上升的趋势。10月采收样品中挥发性成分总相对含量最高，11-12月样品中挥发性成分总相对含量逐渐下降，于12月达到最低值，在次年1-2月样品中逐渐上升；醇类和醛类在10-11月样品中相对含量较高，而单萜类、酮类、酯类在次年1-2月样品中相对含量较高。基于偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）模型，以变量投影重要性分析值（VIP）大于1筛选了己醛、α-蒎烯和α-侧柏烯等12种可用于区分不同采收时间的潜在标记物。芳樟醇，α-蒎烯，α-松油醇和香茅醛等为不同采收时间藏橘皮挥发性成分的基本组成部分，相对含量较高，根据其高低可将藏橘皮的化学型归属为芳樟醇/α-蒎烯型，与文献报道和课题组研究的广陈皮、川陈皮、浙陈皮、椪柑等化学型不同，表明藏橘皮风味独特。本章研究为藏橘的合理采收和开发藏橘皮挥发油类产品提供参考。 2.不同采收时间藏橘皮非挥发性成分比较研究 既往文献报道，柑橘果皮中非挥发性成分主要含有黄酮类、生物碱类、柠檬苦素类等活性成分，但未见系统研究藏橘皮不同采收时间的非挥发性成分组成及动态变化规律。代谢组学技术可提供组分分离和MS特征以鉴定尽可能多的代谢物，通常可以涵盖植物中具有中等极性的常见代谢物，用于探究未知对象的化学特征。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的代谢组学技术，从不同采收时间藏橘皮中共鉴定出1878种代谢物，数量较为丰富的是黄酮类（737种），酚酸类（364种），生物碱（276种），木脂素和香豆素类（203种）和萜类（120种）；主要为黄酮类化合物，相对含量为62.04%。以VIPgt;1，且Plt;0.05的标准筛选差异代谢物，共筛选出了62个受采收时间影响显著的关键差异代谢物。不同采收时间藏橘皮中非挥发性成分含量总体上呈现先降低后升高的趋势，于12月样品中含量达到最低值，但12月样品中代谢物种类是最多的，与挥发性成分变化趋势相似，结合文献报道，推测与温度影响藏橘皮内参与次生代谢相关酶活性有关。KEGG富集分析结果表明，差异代谢产物显著富集于辅助因子的生物合成，黄酮类化合物的生物合成，氨基酸的生物合成和单萜类成分的生物合成等通路。本章研究为藏橘的合理采收和开发藏橘皮活性成分提供参考。 3.不同采收时间藏橘皮黄酮类成分差异比较研究 基于文献报道及《中国药典》2020年版一部陈皮项下相关规定，以总黄酮，芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、甜橙黄酮和橘皮素等5种黄酮类成分为指标，采用紫外-可见分光光度法（UV）检测不同采收时间藏橘皮中总黄酮和高效液相色谱法（HPLC）同时检测5种黄酮。结果表明，不同采收时间藏橘皮中总黄酮成分含量变化显著，总黄酮含量从10月采收样品的7.43%降低到次年2月采收样品的5.27%；橙皮苷从10月采收样品的6.09%降低至次年2月采收样品的3.80%；芸香柚皮苷、橙皮苷和川陈皮素的含量呈现先降低后升高的趋势，各采收时间样品中的甜橙黄酮和橘皮素含量无显著变化；藏橘皮中橙皮苷含量符合《中国药典》2020年版一部陈皮项下橙皮苷含量不低于3.5%的规定。本章研究为藏橘皮的药用价值提供参考。 4.不同采收时间藏橘皮体外抗氧化、降脂活性比较研究 已有研究表明橘皮提取物具有的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒和降脂等作用。本章实验基于对藏橘皮化学成分的研究结果，比较研究了不同采收时间藏橘皮抗氧化活性（DPPH、ABTS自由基清除率和FRAP总抗氧化能力）和体外降脂活性（胰脂肪酶抑制率），并初步探讨了藏橘皮醇提物对3T3-L1细胞成脂分化的抑制作用、脂质积累及脂质代谢中氧化应激相关酶的影响。不同采收时间藏橘皮的抗氧化活性呈现先降低后增加的趋势，均在12月采收样品中达到最低值。各组间DPPH清除率存在显著差异（Plt;0.05）；ABTS清除率和FRAP总抗氧化能力变化趋势一致，各组间无显著性差异；不同采收时间藏橘皮（10 mg·mL-1）脂肪酶抑制率为28.04%~55.40%，10月采收的藏橘皮脂肪酶抑制率最低，12月采收的藏橘皮脂肪酶抑制率最高，显著低于阳性对照奥利司他的脂肪酶抑制率（79.43%），变化趋势与抗氧化活性相反。细胞实验结果：不同采收时间藏橘皮醇提物浓度为2 mg·mL-1时，能显著抑制3T3-L1细胞的成脂分化及分化后脂肪细胞内的脂滴积累；提高分化后脂肪细胞外游离脂肪酸（FFA）和甘油的含量，说明藏橘皮醇提物能促进脂肪细胞的脂解代谢，次年1月采收藏橘皮FFA和甘油含量均显著低于其余4组，12月采收样品FFA和甘油含量最高；不同采收时间藏橘皮醇提物均能显著降低细胞内活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平，显著提高细胞超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平， 12月采收藏橘皮对细胞抗氧化活性高于其余4组样品。相关性分析结果表明，藏橘皮中发挥抗氧化活性和降脂活性的成分不同，邻苯二甲酸、2-羟基-3-苯丙酸、表儿茶素、槲皮素、橙皮苷、甜菜碱、伞形酮、佛手苷内酯等化合物与抗氧化活性呈显著正相关；2-苯乙酰胺和腐胺等化合物与降脂活性呈显著正相关。本章研究为藏橘皮综合开发利用提供依据。
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