摘要
目的： 骨肉瘤是恶性程度极高的原发性肿瘤，目前仍难以治愈。虽然辅助和新辅助化疗的引入有效提高了骨肉瘤患者的生存率并改善了患者的生活质量，但骨肉瘤患者的预后仍然处于较差水平。去泛素化蛋白酶7（Ubiquitin-specific protease7, USP7）是泛素特异性蛋白酶家族的成员之一，参与多种肿瘤细胞恶性生物学过程和进展，然而，USP7在骨肉瘤中的作用机制少有研究。目前，糖代谢已经被认为是肿瘤的生化指纹，其在骨肉瘤的发生及恶性进展中发挥重要作用，己糖激酶2（HK2）作为催化葡萄糖代谢的关键限速酶，是启动糖代谢的关键分子，研究证明 HK2 在肿瘤的进展中扮演着重要角色。基于此，本研究旨在阐明 USP7通过调控HK2促进骨肉瘤糖酵解水平及生长的作用研究，并为骨肉瘤的临床治疗提供新的策略和理论依据。 方法： 1、采用蛋白质印迹法（ Western Blotting ）、免疫组织化学染色（Immunohistochemistry, IHC）及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析骨肉瘤组织及细胞中USP7的表达。 2、将构建好的shNC及四种shUSP7慢病毒感染USP7表达最高的骨肉瘤细胞系，采用qRT-PCR及Western Blotting挑选出USP7最佳敲低效果的慢病毒稳转细胞株，采用CCK8、平板克隆实验、EdU实验观察细胞增殖能力的变化。将构建好的USP7过表达慢病毒感染USP7表达最低的骨肉瘤细胞系，采用CCK8、平板克隆实验、EdU 实验观察细胞增殖能力的变化。将构建好稳定表达shNC/U2OS、shUSP7/U2OS的细胞株，分别注射入裸鼠皮下成瘤模型中，每5天测量一次肿瘤体积， 5 周后处死小鼠，取出瘤体，分别测量 shNC/U2OS、shUSP7/U2OS组的瘤体大小。 3、改变USP7在骨肉瘤细胞的表达后，分别进行ATP生成实验、葡萄糖消耗实验、乳酸生成实验、葡萄糖-6-磷酸实验，评估骨肉瘤细胞的糖酵解水平。采用Western Blotting、免疫组织化学染色（Immunohistochemistry, IHC）及qRT-PCR分析骨肉瘤组织及对应的癌旁组织中HK2的表达。改变USP7在骨肉瘤细胞的表达后，进一步进行qRT-PCR及Western Blotting分析HK2的表达情况。 4、在U2OS骨肉瘤细胞中下调USP7表达的同时上调HK2的表达后，采用CCK8、平板克隆实验、EdU实验观察肿瘤细胞增殖情况；并且分别进行ATP生成实验、葡萄糖消耗实验、乳酸生成实验、葡萄糖-6-磷酸实验，评估骨肉瘤细胞的糖酵解水平。 结果： 1、Western Blotting、免疫组织化学染色（Immunohistochemistry, IHC）及qRT-PCR结果显示USP7在骨肉瘤组织和细胞系中显著高表达（plt;0.01）。 2、在U2OS骨肉瘤细胞中下调USP7的表达，体外增殖实验证明骨肉瘤细胞增殖显著减少（plt;0.05），糖酵解相关实验证明骨肉瘤细胞糖酵解水平降低（plt;0.05）；与之相反，在143B骨肉瘤细胞中上调USP7的表达，骨肉瘤细胞增殖显著增加（plt;0.05），糖酵解水平也显著增加（plt;0.05）；裸鼠皮下荷瘤实验证实了下调USP7后骨肉瘤在体内生长也受抑制（plt;0.05）。 3、相对于癌旁组织，HK2在骨肉瘤组织中高表达，且与USP7的表达呈正相关。进一步，我们研究表明在下调USP7的骨肉瘤细胞中过表达HK2能部分逆转下调USP7所导致的增殖能力下降和糖酵解水平的降低，证明HK2介导了USP7调控骨肉瘤增殖及糖酵解水平。 结论： 1、USP7 在骨肉瘤细胞及组织中高表达，且其表达水平与骨肉瘤细胞糖酵解水平及增殖能力密切相关。 2、USP7通过正向调控HK2的表达进而影响骨肉瘤糖酵解及生长水平。
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