摘要
肝纤维化（Hepatic fibrosis）是由多种生理病理因素导致的一种肝脏组织持续性损伤修复进程。其主要特点为肝脏组织中大量细胞外基质的过度沉积与胶原纤维蛋白的异常增生，从而对肝脏的正常生理功能造成破坏性的影响。在肝纤维化过程中，活化的肝星状细胞会过度合成胶原纤维蛋白与分泌大量细胞外基质。因此，肝星状细胞的增殖活化在肝纤维化进程中具有重要作用。 铁死亡（Ferroptosis）是一种铁离子参与并激活氧化应激的新型细胞死亡方式，在多种疾病中具有重要的调节作用。近期有研究报道，在肝星状细胞中使用索拉菲尼（Sorafenib）与爱拉斯汀（Erastin）诱导铁死亡，可抑制或逆转肝纤维化进程。 Hippo/Yap-1通路是一种生长调控的信号通路，与细胞中发生的增殖、分化及衰老等生理过程有着紧密的联系。有实验研究发现，细胞内Ca2+的信号传递可激活Yap-1（Yes-associated protein 1）的活性，而Yap-1可对铁死亡进程有抑制作用。 酸敏感性离子通道（Acid-Sensing Ion Channels）是一类在哺乳动物神经系统中广泛分布的质子门控性阳离子通道，其可由细胞酸环境中质子增多所激活。在ASICs中众多亚基中，ASIC1a是其中表达与占比最多的亚型之一，当ASIC1a激活时，可介导Ca2+内流，对体内生理病理条件产生影响。 课题组前期研究表明：ASIC1a促进肝纤维化中肝星状细胞的增殖活化。ASIC1a可介导Ca2+内流，进而调控Ca2+/CaMKII通路，促进肝星状细胞活化及肝纤维化进程。而Ca2+的信号传递在铁死亡中发挥重要的作用，ASIC1a是否通过介导Ca2+内流，对Hippo/Yap-1通路产生影响，进而影响肝星状细胞铁死亡？其相关机制如何？目前国内外无相关文献报道。 因此，本课题将从体内实验出发，观察过表达ASIC1a对肝纤维化中铁死亡的影响。在体外肝星状细胞中，探究ASIC1a是否通过Hippo/Yap-1通路调控肝星状细胞中铁死亡，进而影响肝星状细胞活化。为以ASIC1a与Hippo/Yap-1通路为靶点治疗肝纤维化的新药设计开发提供新方向。 目的：研究ASIC1a在肝纤维化中对铁死亡的影响以及ASIC1a通过Hippo/Yap-1通路对肝纤维化肝星状细胞中铁死亡的调控机制。 方法：体内实验：使用重组腺相关病毒rAAV8感染实验小鼠肝脏，使其过表达ASIC1a，并在此基础上构建索拉菲尼治疗的肝纤维化模型。实验动物造模完成后，使用肝脏病理学染色观察与血清学检测对各实验组中的肝损伤程度进行评价，使用免疫组化、qRT-PCR、Western Blot法检测各实验组小鼠肝脏组织中Collagen-I、ASIC1a、α-SMA、Yap-1、p-Yap-1、ACSL4、GPX4、MST1/2与LATS1/2的表达水平，MDA、GSH、组织铁试剂盒检测铁死亡相关指标。 体外实验：使用RNA质粒技术转染HSC-T6细胞，在细胞中过表达或沉默ASIC1a，并在此基础上使用PDGF与Sorafenib刺激HSC-T6细胞，构建活化的HSC-T6细胞中发生铁死亡的细胞模型。细胞造模完成后，使用免疫荧光法、qRT-PCR、Western Blot法检测各组细胞中Collagen-I、ASIC1a、α-SMA、Yap-1、p-Yap-1、ACSL4、GPX4、MST1/2与LATS1/2的表达水平，使用MDA、GSH、细胞铁以及ROS试剂盒检测铁死亡相关指标，使用钙离子探针Fluo-4 AM检测HSC-T6细胞中Ca2+浓度。 结果：在索拉菲尼治疗的肝纤维化小鼠肝脏中ASIC1a的表达水平明显降低，给予腺相关病毒过表达ASIC1a处理后，索拉菲尼的治疗作用受到抑制，索拉菲尼诱导的铁死亡水平也受到抑制。进一步在体外探究采用过表达质粒和沉默ShRNA干预 ASIC1a对索拉菲尼诱导的肝星状细胞铁死亡的影响，发现体外诱导肝星状细胞铁死亡过程依赖于ASIC1a。进一步探讨ASIC1a调控肝星状细胞的铁死亡的潜在机制，结果显示：在铁死亡和肝纤维化相关的HSC-T6细胞系中Yap-1的表达显著上调。ASIC1a的过表达能够促进Yap-1核转位，从而调控Hippo/Yap-1通路信号的活性。进一步研究发现PDGF-BB诱导活化的肝星状细胞中细胞质Ca2+浓度显著增加，而索拉非尼诱导铁死亡后可减少活化的肝星状细胞中的Ca2+内流。索拉非尼处理后，当过表达ASIC1a时Ca2+内流显著增加，胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM干预消除过表达ASIC1a诱导的细胞内Ca2+积累。表明Yap-1的活化依赖于ASIC1a诱导的Ca2+内流，ASIC1a通过调控Ca2+依赖的Hippo/Yap-1通路调控肝星状细胞的铁死亡。 结论：ASIC1a通过Ca2+内流激活Hippo/Yap-1通路中Yap-1的表达，进而调控肝星状细胞的铁死亡，促进肝纤维化进程。
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