摘要
背景与目的： 牙周炎（Periodontitis，PD）是以牙龈软组织炎症、骨吸收为特征的细菌感染性疾病，已成为成人牙齿缺失的重要原因。在过去20年中，牙周炎的患病率持续增加，影响着全球人口的20-50%，使其成为一个重大的全球公共卫生问题。此外，PD与全身多种系统性疾病密切相关，如糖尿病、动脉粥样硬化、不良妊娠和类风湿性关节炎等。近年来的研究调查发现，PD与多种肝脏疾病的发展有关，如非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）、肝纤维化和肝细胞癌。然而，牙周局部炎症影响远端肝脏功能的途径及具体分子机制尚不清楚。外泌体（Exosomes，EXO）是一种几乎所有细胞都能分泌的细胞外囊泡，可以将生物活性物质从供体细胞运输到受体细胞中，在组织器官间的通讯联络及远距离调控中发挥重要作用。外泌体是否桥接了牙周组织与肝脏间的通讯联络？PD相关的外泌体对肝脏的具体影响及涉及的分子机制是什么？这是一个有趣的科学问题。在本研究中，将牙周相关的两种细胞作为外泌体供体细胞，包括THP-1巨噬细胞和人牙周膜成纤维细胞（Human periodontal ligament fibroblasts，hPDLFs），人肝癌细胞HepG2作为外泌体受体细胞，并通过体内和体外实验探究PD对肝脏损伤的分子机制，为预防和治疗与牙周炎相关的肝病提供理论基础。 方法： 1.采用丝线结扎法构建8w大鼠PD模型，牙周组织通过亚甲蓝染色检测牙槽骨丧失水平；HE染色检测病理学变化；qRT-PCR检测牙龈组织中IL-1β和TNF-αmRNA的表达水平。肝脏组织通过HE染色检测病理学变化；检测甘油三酯（Triglyceride，TG）含量；通过qRT-PCR检测炎症相关基因（IL-1β和TNF-α）、脂肪形成相关的基因（Srebp1、SCD-1、Fasn和CD36）以及脂肪分解代谢相关的基因（PPARα、Cpt1α和Acox1）的表达水平；通过Western blot检测SCD-1、AMPK以及p-AMPK蛋白表达水平。 2.体外实验，牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Porphyromonas gingivalis-lipopolysaccharides，Pg-LPS）活化THP-1巨噬细胞和hPDLFs细胞，建立PD细胞模型。使用GW4869处理THP-1巨噬细胞和hPDLFs细胞，抑制细胞外泌体的释放，收集细胞上清与HepG2细胞共培养，检测HepG2细胞中TG含量水平，油红O染色检测HepG2细胞脂滴生成情况，qRT-PCR检测SCD-1mRNA表达水平以及Western blot检测SCD-1、AMPK以及p-AMPK蛋白表达水平。 3.差速超速离心法提取hPDLFs细胞外泌体，通过透射电镜（Transmission electron microscope，TEM）检测外泌体的形态；纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis，NTA）鉴定外泌体的大小；通过Western blot检测外泌体标志蛋白（CD9和CD63）的表达，对外泌体的表征进行鉴定。DIO荧光标记hPDLFs细胞外泌体，与HepG2细胞共培养，荧光显微镜下观察外泌体能否能被肝细胞摄取。提取Pg-LPS活化的THP-1巨噬细胞和hPDLFs细胞衍生的外泌体（LPS-EXO），并分别与HepG2细胞共培养。检测HepG2细胞中TG含量水平，油红O染色检测HepG2细胞脂滴生成情况，qRT-PCR检测SCD-1mRNA表达水平以及Western blot检测SCD-1、AMPK以及p-AMPK蛋白表达水平，以探究LPS-EXO能否促进肝细胞损伤和脂肪变性。 4.DIR荧光标记hPDLFs细胞来源外泌体，通过尾静脉注射入小鼠体内，小动物活体成像仪下观察外泌体能否被小鼠肝脏摄取。尾静脉分别注射两种细胞来源的LPS-EXO至小鼠体内，2周后通过HE染色法检测肝脏组织病理学变化，检测肝脏组织中TG含量，qRT-PCR检测SCD-1mRNA表达水平以及Western blot检测SCD-1、AMPK以及p-AMPK蛋白表达水平，以探究LPS-EXO能否促进小鼠肝脏损伤和脂肪变性。 结果： 1.丝线结扎可成功构建大鼠牙周炎模型：与对照组相比，PD大鼠牙槽骨丧失水平增加；牙周组织出现炎症改变，炎细胞浸润增多；牙龈组织中IL-1β和TNF-αmRNA的表达水平上调。大鼠肝脏组织检测结果表明PD大鼠肝脏出现炎症改变以及脂肪变性：与对照组相比，PD大鼠肝脏组织中可见炎细胞浸润以及大小不一的空泡生成；TG含量增多；IL-1β和TNF-αmRNA表达水平上调、Srebp1、SCD-1、Fasn和CD36mRNA表达水平上调、PPARα、Cpt1α和Acox1mRNA表达水平下调；SCD-1蛋白表达水平上调、p-AMPK蛋白表达水平下调、p-AMPK/AMPK比值减小。 2.Pg-LPS活化的THP-1巨噬细胞和hPDLFs细胞，细胞培养上清可诱导肝细胞脂肪变性：油红O染色显示HepG2细胞脂滴生成增加，细胞中TG含量增加，SCD-1mRNA及蛋白表达水平上调，p-AMPK/AMPK比值减小，AMPK通路被抑制。外泌体抑制剂GW4869可有效缓解Pg-LPS活化的，牙周相关细胞引起的肝细胞的成脂改变，HepG2细胞中脂滴生成及TG含量减少，SCD-1mRNA及蛋白表达水平有所下调，p-AMPK/AMPK比值上升。 3.TEM观察可见，提取的外泌体成球形、扁球形或杯状结构，NTA检测外泌体直径分布在50–150nm左右，Western blot检测其高表达CD63和CD9。荧光显微镜下观察到DIO标记的EXO可被HepG2细胞成功摄取。LPS-EXO添加到HepG2细胞内，24h后可诱导了肝细胞脂肪变性，HepG2细胞内脂滴生成增加，TG水平升高，SCD-1mRNA及蛋白表达水平上调，抑制了AMPK通路的激活，p-AMPK/AMPK比值减小。 4.尾静脉注射的DIR标记的外泌体可在小鼠肝脏中富集，2周后LPS-EXO可诱导小鼠肝脏脂肪变性。小鼠肝脏中炎症细胞浸润增多，TG含量增加，SCD-1mRNA及蛋白表达水平上调，AMPK通路被抑制，p-AMPK/AMPK比值减小。 结论： 本研究初步阐明了PD促进肝脏脂肪变性的分子机制：Pg-LPS活化的，巨噬细胞和hPDLFs衍生的外泌体，可上调肝脏细胞SCD-1的表达和抑制AMPK信号通路活化，增加了HepG2细胞和小鼠肝脏中TG含量和脂滴积累，从而促进肝脏损伤和脂肪变性的进展。牙周炎相关外泌体可引起肝脏脂肪合成相关mRNA表达上调，促进TG合成，并可能通过SCD-1/AMPK信号通路影响肝脏脂肪代谢，从而加重NAFLD进展。
NETL