摘要
生物脱氮因价格低廉、效率高等优势被广泛应用于污水处理。生物脱氮过程需要添加甲醇、乙酸钠、葡萄糖等外部碳源，但由于其存在成本高、污泥产率高、碳排放多等缺点，故寻找一种经济、安全的碳源十分关键。餐厨垃圾是一种易于生物降解的厌氧消化底物，具有大量碳水化合物、脂质、蛋白质和适度的水分含量,作为一种潜在的废弃生物质能源，利用餐厨垃圾协同处理低碳氮比工业废水，不仅可以降低工业废水处理成本，而且可以实现以废治废。 热带假丝酵母(Candida tropicalis)是一种具有工业意义的非常规酵母，具有细胞生长速度快、环境耐受能力强且底物利用范围广等特点，能够利用工业污水中有机物分泌有机酸和酶以达到良好的去除效果，具有广阔的前景。本文首先围绕热带假丝酵母中乙酸代谢途径的关键基因和影响途径进行基因改造，构建高效产乙酸菌株;其次，通过筛选菌株中高效表达的启动子并异源表达α-淀粉酶构建高效利用淀粉产乙酸菌株;最后，利用餐厨垃圾为唯一碳源，联合培养高产乙酸菌株与脱氮菌株，测定污水总氮去除率，主要研究如下: 1.热带假丝酵母尿嘧啶缺陷型菌株筛选 以本实验室筛选保藏的热带假丝酵母(Candida tropicalis)为出发酵母，通过常压室温等离子体(ARTP，atmospheric and room temperature plasma)和亚硝基胍(NTG，nitrosoguanidine)双重多次诱变，并利用制霉菌素和5-氟乳清酸(5-FOA)选择培养基筛选，获得了 C.tropicalis的尿嘧啶缺陷型菌株1株，命名为C.tropicalis C1,进行PCR扩增和DNA测序分析，发现URA3基因测序291-562bp中出现突变约60处，碱基缺失约15处，传代多次并测序，URA3基因未发生回复突变，最终获得稳定的尿嘧啶缺陷型菌株。 2.基于乙酸代谢通路改造构建乙酸高产菌株及其乙酸产量鉴定 以乙酸代谢途径中关键基因ACS为目标基因，构建了ACS1基因单拷贝敲除菌株C.tropicalis C1-1和ACS2基因单拷贝敲除菌株C.tropicalis C1-2。提取菌株的总RNA进行qRT-PCR分析，基因表达水平明显降低:ACS1基因相对表达量降低了 30.13％,ACS2基因降低了 47.94％;在酵母基本培养基(YPD)培养24h 时，C.tropicalis C1 菌株乙酸产量为 0.759 g/L,C.tropicalis C1-1 菌株乙酸产量为1.458 g/L,C.tropicalis C1-2菌株乙酸产量为2.082 g/L。结果表明C.tropicalis C1-2菌株可高效产生乙酸。 3.筛选C.tropicalis菌株的强启动子 在YPD培养基中，C.tropicalis菌株分别在静置培养和摇床培养条件下不同时期收菌并进行蛋白质组学分析。结果表明:共鉴定到26629个肽段，3465个蛋白，蛋白质分子量主要聚集在1-141 kDa大小，不同培养条件下菌株蛋白表达有明显差异。在静置的培养条件下，酵母细胞发生了复杂的耐受反应网络。从静置和摇床培养条件下均高度表达的十个上调差异蛋白中挑取三个蛋白，通过NCBI网站查询基因信息进行后续实验。 选取基因的启动子PGADPH、PPGK、PFBA1,以绿色荧光蛋白作为表达蛋白构建质粒，分别利用荧光显微镜和绿色荧光蛋白mRNA相对表达量进行定性定量分析。将PGADPH表达的绿色荧光蛋白的mRNA含量定为100％，PFBA1的绿色荧光蛋白的相对mRNA丰度为31.27％,PPGK绿色荧光蛋白的相对mRNA丰度为27.65％。分子实验结果与蛋白质组学数据进行双重验证，证明PGADPH在静置和摇床培养条件下均高效表达基因。 4.C.tropicalis C1-2菌株异源表达a-淀粉酶 在C.tropicalis C1-2菌株中利用筛选的强启动子PGADPH异源表达白曲霉菌(Aaspergillus albicans)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、许旺酵母(Schwanniomycess occidentalis)的 α-淀粉酶，命名为 C.tropicalis C1-2-1、C.tropicalis C1-2-2、C.tropicalis C1-2-3、C.tropicalis C1-2-4,定性定量检测菌株α-淀粉酶活性。结果表明:4株菌株在以淀粉为碳源的补充培养基中均生长状态良好;在培养24 h后取上清检测乙酸含量，C.tropicalis C1-2-1 乙酸产量最高，可达 1.592 g/L。 5.C.tropicalis C1-2-1与异养硝化-好氧反硝化细菌P.stutzerii SDU10联合培养处理污水 从稀释后总氮含量100mg/L、COD含量1190 mg/L的污水出发，分别以淀粉和餐厨垃圾为碳源，探究C.tropicalis C1-2-1与异养硝化-好氧反硝化细菌Pseudomonas Stutzerii SDU10(P.stutzerii SDU10)去除总氮和 COD 含量的能力。结果表明:在 C.tropicalis C1-2-1 和 P.stutzerii SDU10“一先一后”联合接种，总氮和COD的去除率最高。当以淀粉为碳源时，总氮和COD去除率分别达到75.46％和93.28％;当以餐厨垃圾为碳源时，总氮和COD去除率分别达到78.3％和 83.42％。 综上所述，本论文综合利用基因工程、等离子体诱变、启动子优化、基因敲除、蛋白质组学分析等技术手段构建得到高产乙酸的热带假丝酵母工程菌株，通过与异养硝化-好氧反硝化细菌P.stutzerii SDU10菌株联合培养，降低了工业污水中的总氮含量。本论文研究内容及研究成果能够为菌株联合培养降低污水总氮含量提供新思路和新方法。
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