摘要
番茄是全世界栽培最为普遍的果菜之一，也是研究茄科开花植物的模式物种。开花植物的花粉，在世代交替和作物生产中都具有重要作用。花粉发育中，花粉母细胞经过减数分裂产生的单倍体小孢子需要经历一个独特的减数分裂后发育机制，其首先通过不对称有丝分裂产生命运和发育潜能完全不同的大的营养细胞和包裹于营养细胞内的小的生殖细胞。营养细胞在合适条件下发育成极性生长的花粉管，而生殖细胞经过有丝分裂产生精细胞。因此，小孢子发育和不对称有丝分裂的调控机制研究，对深入了解花粉发育过程至关重要，但目前的研究报道仍是有限的。 我们前期利用小孢子、生殖细胞与精细胞作为研究材料，同时选取成熟花粉与叶片作为对照，通过RNA-seq筛选了花粉不同细胞类型的优势表达基因。该论文在小孢子优势表达基因中，发现了一个RING类E3泛素连接酶(RING-type E3 Ubiquitin Ligase)编码基因，将其命名为REUL。通过RT-PCR分析，进一步证明REUL只在四分体和小孢子中表达，而在二核花粉、成熟花粉、雌蕊、种子以及叶片中不表达。为了解析REUL在花粉发育中的功能，我们以MicroTom番茄为材料，通过CRISPR/Cas9编辑技术得到了基因型为reul/+的突变体植株。reul/+突变体有近50％的成熟花粉败育。通过reul/+突变体自交以及reul/+突变体与野生型互为父母本的杂交实验，证明reul/+突变体花粉败育表型是REUL功能缺失引起，且REUL通过雄配子遗传，不影响雌蕊功能。DAPI染色显示reul/+突变体四分体和早期小孢子的细胞核形态和数目，与野生型没有明显差异，小孢子晚期能建立极性，但部分晚期小孢子细胞核出现凝集。FDA染色结果表明reul/+突变体小孢子时期细胞活力正常;而在成熟花粉时期，形态异常的花粉细胞活力降低。以上结果表明REUL可能通过影响小孢子发育调控花粉育性。 瞬时表达实验证明REUL主要定位于细胞核。体外泛素化实验结果表明REUL可以发生自泛素化，因此REUL具有E3泛素连接酶活性。为了寻找REUL可能的底物，通过酵母双杂交筛选了 REUL互作蛋白，发现REUL能与bHLH转录因子bHLH1,bHLH2和bHLH3互作。Co-IP验证了 REUL与bHLH1和bHLH3的互作。这些结果表明REUL可能通过与bHLH转录因子互作调控小孢子发育，进而影响花粉育性。 在此基础上，通过RNA-seq比较分析了reul/+突变体与野生型小孢子发育时期花药转录组的差异。相比于野生型，reul/+突变体分别有672个显著上调和208个显著下调的差异表达基因。GO富集分析发现上调差异表达基因中主要富集胁迫相关基因，而下调差异表达基因无显著富集。通过预测bHLH1和bHLH3的DNA结合序列，发现上调差异表达基因的启动子区富集bHLH类转录因子结合位点E box(5''-CANNTG-3'')。小孢子不对称分裂标记基因SCP在突变体花药中显著上调表达。在转录组检测的48个细胞周期蛋白基因中，34个显示下调表达特性，其中8个是type-A细胞周期蛋白基因，12个是type-D细胞周期蛋白基因。这些结果表明REUL通过bHLH介导的相关基因表达影响小孢子发育。 综上，REUL是一个能在细胞核定位的RING类E3泛素连接酶，通过影响小孢子发育调控花粉育性。REUL可能通过与bHLH转录因子互作和泛素化修饰调节bHLH蛋白水平，从而调控小孢子发育。该研究揭示了一个新的小孢子发育调控因子和分子网络，为深入理解小孢子发育和花粉育性的调控机制和分子网络提供了新的切入点。
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