摘要
水稻粒型是影响产量的重要农艺性状，其优异分子模块的解析及利用对于我国种业振兴、打好种业“翻身仗”以及粮食安全具有重要意义。同时，解析水稻粒型调控网络也是发育生物学中重要的科学问题。组蛋白乙酰基转移酶(Histone acetyltransferase,HAT)能够将乙酰辅酶A的乙酰基团转移到组蛋白的赖氨酸残基上，通过影响染色质的开放状态来调控基因的转录，进而参与对生长发育等众多生物学过程的调控。然而，HAT在作物农艺性状中的调控机制和网络报道较少。本文以水稻GNAT型组蛋白乙酰基转移酶HHC4为研究对象，综合分子生物学、细胞学、遗传学等手段探究HAT介导的水稻粒型调控通路。 本研究发现过表达GW6a同源基因(HHC2,HHC3,HHC4和HHC7)均导致水稻籽粒变长、增重。但是，不同于GW6a通过控制颖壳细胞增殖调控粒型，其序列相似性最低的同源蛋白HHC4同时调控细胞增殖与扩张两个进程，而且大田种植发现过表达HHC4显著增加水稻单株产量。生化实验和表达模式分析表明HHC4具有HAT活性，主要定位于细胞核中，并在穗发育时期高表达。进一步，ChIP-seq分析发现HHC4靶向启动子序列的偏好性(ABRE元件)可能与bZIP类转录因子有关。通过IP-MS发现穗发育过程中HHC4能与bZIP23在细胞核内结合，并经Y2H、BiFC、Co-IP、Pull-down和SLC实验进一步证实它们之间能够直接相互作用。同时，过表达bZIP23也能够同时调控细胞增殖与扩张增加水稻粒长和粒重。通过幼穗材料的ChIP-seq分析以及Y1H、ChIP-qPCR、EMSA和DLR等实验证明了 bZIP23/HHC4复合体特异性共靶向粒型基因GRF4、PHI-1、LAX2和RAE2启动子中的ABRE元件，且HHC4能够促进bZIP23对靶基因的转录激活效应。此外，桥接蛋白ADA2能够与HHC4、bZIP23两两相互作用形成一个SAGA类型HAT三元复合体，该复合体同时富集于靶基因相同的启动子区段进一步促进bZIP23对靶基因的激活效应。遗传分析发现HHC4/ADA2/bZIP23位于同一遗传通路调控水稻粒型。 另一方面，本研究还通过Y2H筛选到一个可能与HHC4互作的GSK3类蛋白激酶TGW3。研究发现TGW3也是通过影响细胞增殖和细胞扩张来负调控水稻粒型，并且敲除TGW3导致单株产量显著提高。进一步的蛋白互作实验证实了HHC4与TGW3能够直接相互作用，且两者的互作在各自的同源蛋白家族中具有特异性。通过体外、体内生化实验及质谱分析发现TGW3主要磷酸化HHC4蛋白的189位和190位丝氨酸残基(HHC4S189/190)。荧光共定位及核质分离实验表明TGW3介导的S189/190位点磷酸化能够抑制HHC4的核质分布比例。Semi-in vivo蛋白降解实验和荧光共定位表明TGW3介导的S189/190位点磷酸化能够降低HHC4的蛋白稳定性，促进HHC4通过26S蛋白酶体途径及自噬体途径降解。此外，体外酶活实验发现非磷酸的HHC4S189/190A突变能够显著提高其HAT活性，而模拟磷酸化的HHC4S189/190D则导致其HAT活性降低。进一步通过幼穗转录组学分析发现TGW3敲除和HHC4过表达引起的上调基因显著富集于细胞核内的转录调节因子及基因表达分类中，同时TGW3敲除和HHC4过表达能够同时提高靶基因启动子处与转录激活状态相关的组蛋白修饰（H3ac，H4ac,H3K4me3）水平，进而促进靶基因（GRF4、PHI-1、LAX2和RAE2）的转录表达。最后，遗传杂交分析发现HHC4/TGW3位于同一遗传通路调控水稻粒型。 最后，通过Y2H、Co-IP、BiFC和SLC蛋白互作实验发现TGW3介导的HHC4S189/190位点磷酸化抑制了 bZIP23/HHC4的相互作用。进一步，ChIP-qPCR实验发现HHC4S189/190A突变显著提高HHC4对靶基因启动子的富集水平，而HHC4S189/190D则降低了 HHC4的富集水平，最终导致了 S189/190A突变增强了HHC4对bZIP23转录激活的促进作用。同样，转基因表型分析证实了 S189/190位点的磷酸化修饰状态直接影响了 HHC4对粒型的调控功能。遗传分析发现TGW3/bZIP23位于同一遗传通路调控水稻粒型。 综上所述，本研究解析了一个以HAT为核心的粒型表观遗传调控通路TGW3-HHC4/ADA2/bZIP23。其中，HHC4 通过与 ADA2 和 bZIP23 互作在核内形成乙酰基转移酶复合体，共同靶向并促进粒型基因GRF4、PHI-1、LAX2、RAE2的转录，调控颖壳细胞增殖和扩张，进而影响水稻粒型;此外，TGW3介导的HHC4S189/190位点磷酸化抑制了 HHC4在细胞核内的分布、蛋白稳定性、HAT活性以及与bZIP23的相互作用，进而减弱了 HHC4作为转录共激活因子的功能，最终影响水稻粒型。本研究结果有助于更好地理解以HAT为核心的表观调控网络在水稻种子发育中的重要作用，同时为水稻高产育种提供了新的思路。
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