摘要
背景：感染性腹泻是一个全球性的公共卫生问题，每年导致数十亿人患病，数百万人死亡。引起感染性腹泻的肠道致病菌主要有沙门氏菌、志贺氏菌等，它们通过污染的食物和水源或直接接触传播，引发腹泻、脱水和营养不良等症状。当前，肠道致病菌的检测方法从传统的微生物培养到分子生物学技术不等，各有优势与局限。微生物培养虽为金标准，但耗时且某些病原体难以培养；PCR 和二代测序提供了灵敏度高和可以发现新病原体的优点，但成本高且操作复杂。免疫学方法虽能快速检测，但灵敏度和特异性不足，难以满足临床对多病原体同时检测的需求。因此，开发一种快速、准确且成本效益高的新型检测方法对于感染性腹泻的诊断和治疗具有重要意义。 目的：应用多重 PCR-反向斑点杂交技术和微流控技术, 开发一种快速检测多种肠道致病菌的检测方法，为临床诊断腹泻病原体提供新的技术手段。 方法：首先，对11种肠道致病菌株进行培养，随后对所培养的菌落进行鉴定并提取其DNA。通过GenBank数据库检索11种肠道致病菌的16S rRNA序列以及志贺氏菌的ipaH基因序列，使用SnapGene软件对这些序列进行比对分析。基于比对结果，采用Primer 5.0软件设计用于PCR扩增的引物和特异性探针，其中引物5’端经生物素修饰标记，探针5’端通过氨基修饰标记。随后，对提取的DNA样本进行PCR扩增。之后，手工制备尼龙膜并将设计的特异性探针点样于膜上。PCR产物在高温下解链，与膜上的探针进行杂交反应，接着与HRP标记的链霉亲和素共孵育，随后加入显色液进行显色，以筛选出特异性探针。在确定了11种肠道致病菌的特异性探针之后，将探针转移到DNA微阵列上，随后利用微流控芯片技术对反向斑点杂交条件进行优化，以确定最适宜的反应时间和温度。在此基础上，来进一步验证微流控芯片法的交叉反应性和最低检测限。最终，采用检验科常规培养的60份临床粪便样本，对微流控芯片法进行全面的验证并与常规培养方法对比从而评估本研究方法的性能。 结果：（1）设计的16S rRNA通用引物和ipaH特异性引物成功扩增出目的基因。（2）设计的11种特异性探针在手工的方法下与相应的菌种杂交成功并显色。（3）将探针转移至DNA微阵列后，确定微流控芯片法最适宜的反应时间和温度为45℃时杂交15min。（4）成功建立起基于微流控芯片-多重PCR-反向斑点杂交技术快速检测多种肠道致病菌方法，目的细菌之间无交叉反应且与肠道常见正常菌群也没有交叉反应，同时该方法对革兰阴性菌的检测下限为102 CFU/mL，对革兰阳性菌的检测下限为103 CFU/mL。（5）与传统培养相比较，本研究方法的显示敏感性为100%，特异性为100%，一致率为98.3%。 结论：基于微流控芯片的多重PCR-反向斑点杂交技术为感染性腹泻的快速诊断提供了一种高效、准确且成本效益高的新方法。该技术的开发和应用，有望显著改善感染性腹泻的诊断流程，对提升公共卫生防控水平和降低患者负担具有重要意义。
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