摘要
水稻的产量对于粮食安全有着至关重要的影响，花粉育性是决定水稻产量的重要因素之一。花粉中储藏的碳水化合物为花粉萌发及花粉管伸长提供能量及碳骨架，对于花粉的生物学功能有着决定性作用。研究水稻花粉中碳水化合物的合成和代谢有利于揭示水稻生殖发育的分子机制，对于提高并稳定作物产量具有积极的作用。 本研究通过CRISPR-Cas9技术获得胞质歧化酶突变体dpe2。与野生型相比，dpe2突变体结实率显著降低，仅为15.60～19.66％。Western Blot鉴定结果表明突变体中没有DPE2蛋白表达。使用自身启动子回复突变体中DPE2的表达后,转基因阳性植株结实率回复正常，因此结实率降低表型确实是由于DPE2缺失导致的。正反交实验表明突变体作为父本时，双受精过程不能正常完成，授粉后5 h绝大多数突变体花粉管无法到达柱头基部。但当突变体作为母本时双受精过程正常，柱头可观察到野生型花粉管生长到达柱头基部且伸入珠孔。因此该突变体育性显著降低是由于雄配子体功能异常导致。 对dpe2突变体雄配子体的功能进一步研究，发现花粉的体外萌发率降低，花粉管伸长受阻。GUS染色结果及DPE2-GFP的观察发现DPE2在花粉和花粉管中表达且均匀分布。利用扫描电镜和超薄切片观察花粉形态及结构，发现突变体花粉细胞结构正常，但花粉内淀粉颗粒较小且排列松散。酶活分析表明DPE2是一个麦芽二糖水解酶。对花药中碳水化合物含量的测定发现淀粉及葡萄糖、果糖含量均降低。麦芽二糖作为淀粉降解的主要产物和DPE2的底物，其含量升高了 1.53～1.65倍。另外，花药中ATP的含量显著降低。在花粉萌发培养基中添加ATP和葡萄糖可以部分恢复花粉的萌发能力。 胞质磷酸酶Pho2在dpe2突变体中蛋白含量及表达量均上调。亚细胞定位观察表明DPE2与Pho2均在胞质中表达。Co-IP与BiFC结果显示二者可能存在相互作用。Pho2与DPE2的组织表达相似，均为组成型表达，在花粉中有较明显表达。据本实验室目前对pho2突变体的观察，发现Pho2缺失后结实率降低为35.84％～56.28％,约是dpe2突变体结实率的二倍，暗示DPE2可能在水稻生殖过程中发挥了更主要的功能。 dpe2突变体除了具有结实率降低的表型，其米粉中总淀粉含量和表观直链淀粉含量降低，抗性淀粉含量升高。支链淀粉的链长分布测定发现突变体中DP10～21、DP38～44聚合度的链长含量降低，而DP22～38,DP≥46的支链含量升高。对米粉中可溶性糖含量的检测发现精米粉中葡萄糖含量升高。果糖和蔗糖分别在糙米粉和精米粉中有含量升高的趋势，但突变体的两个株系中只有一个有显著性差异。突变体中麦芽寡糖（分子量大于等于麦芽七糖）含量升高。另外突变体14 d幼苗的地上部高度低于野生型，而突变体和过表达的根长均显著高于野生型。 转录组分析突变体中其他代谢通路的变化，分析结果显示，突变体中有1007个上调基因，138个下调基因。差异基因主要集中在新陈代谢中，其中碳水化合物代谢的差异基因数目最多。差异基因主要富集在淀粉与蔗糖代谢通路，糖酵解与糖异生通路和氧化磷酸化通路。其中淀粉降解的相关基因如GWD、PWD、ISA、AMY表达量均上调。另外DPE1、MEX1、Pho2表达量也显著上调。糖酵解过程中的限速酶HXK、PFK和PK以及其他步骤的催化酶GPI、FBA和gpm表达量也上升。而甘油醛三磷酸脱氢酶GAPDH是糖酵解过程中唯一下调的酶。氧化磷酸化中NADH脱氢酶复合体Ⅰ有三个基因上调表达，ATP合成酶复合体V中有两个基因上调表达，一个基因下调表达。 综上，研究结果表明DPE2的缺失影响了花粉中碳水化合物的积累、阻断了花粉管萌发过程中淀粉降解为麦芽二糖后对麦芽二糖的利用和葡萄糖的产生，导致突变体缺乏葡萄糖、果糖和ATP,花粉管生长的能量和生长原料供应不足。突变体中淀粉降解、糖酵解和氧化磷酸化的代谢通路均受到干扰。因此突变体花粉萌发率降低，花粉管伸长受阻，水稻的受精作用缺陷从而导致水稻雄性不育。Pho2与DPE2在此过程中可能相互作用且功能互补。
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