摘要
应激（Stress）指内外界环境因素刺激时机体出现的身心综合性反应。母婴分离（Maternal Separation，MS）是哺乳动物早期发育过程中遭受不良应激的经典早年应激模型，可导致成年后认知障碍。大脑是应激的主要靶标，海马（Hippocampus，Hip）是哺乳动物中枢神经系统中学习和记忆的关键部位，也是应激导致认知功能损伤的关键靶区。而线粒体作为机体能量代谢的中心，在正常脑功能的维持中至关重要，研究表明应激可以导致线粒体功能损伤，但其具体的机制尚未完全明确。前期研究发现同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）水平升高在应激致认知功能障碍中发挥重要的损伤效应，可能作为转甲基的重要中间产物发挥表观遗传学调控作用，同时 Hcy 对线粒体功能的影响已有报道。N6-甲基腺嘌呤（6mA）修饰是哺乳动物中一种新的表观遗传学修饰方式，可以通过改变DNA二级结构影响生物学功能，但其上游调控分子尚不完全清楚。本研究通过观察母婴分离应激致认知功能障碍过程中Hcy和线粒体功能的变化，揭示了Hcy对线粒体DNA（mtDNA） 6mA修饰的调节机制，从而为阐明 MS应激致认知功能障碍发生的分子机制提供表观修饰调控的理论依据，为改善该类应激人群的精神健康状态提供新的思路。 第一章 Hcy在母婴分离应激致认知障碍和线粒体损伤中的作用 为了观察Hcy对MS应激致大鼠认知功能障碍的影响，探索Hcy在MS应激致线粒体结构功能损伤中的作用。采用 MS 应激模式建立应激致认知功能障碍大鼠模型；采用相关行为学方法（包括 Morris水迷宫实验、旷场实验、新物体识别实验）检测大鼠认知功能变化；采用Hcy ELISA试剂盒检测大鼠血浆及海马组织Hcy水平；采用透射电镜观察大鼠海马神经细胞以及大鼠海马原代神经元和PC12细胞线粒体超微结构变化；采用 ATP/膜电位（MMP）试剂盒检测线粒体膜电位和 ATP产生；采用 O2K检测线粒体呼吸功能和复合体活性。结果显示 MS应激大鼠在空间自主探索能力、空间学习记忆能力较对照组显著降低；血浆和海马组织 Hcy 水平明显升高，并与认知功能呈负相关；与对照组相比，电镜结果显示MS 应激大鼠海马神经细胞的线粒体呈中重度肿胀，多呈圆形，基质溶解、稀疏，嵴大量断裂、缺失；线粒体的总呼吸控制比（RCR）下降，并且与血浆 Hcy呈负相关，线粒体呼吸链复合体 I、IV 的呼吸功能也显著降低， MS 应激大鼠MMP和ATP均显著降低。细胞实验结果显示，100μM Hcy干预大鼠海马原代神经元 24 h 和 48 h 导致 MMP 和 ATP 含量明显降低，线粒体超微结构损伤；而PC12细胞在干预24 h时MMP和ATP含量升高，干预时程延长至48 h后线粒体结构以及MMP和ATP均无明显改变。进一步给予MS模型大鼠复合B族维生素灌胃，可降低模型大鼠血浆和海马 Hcy 水平，改善大鼠认知功能，同时线粒体RCR和复合体 I、IV的呼吸功能得到改善，ATP产生和 MMP增加。以上结果提示Hcy是MS应激诱导大鼠认知功能障碍和线粒体功能损伤的重要介导因子。 第二章 mtDNA 6mA在 Hcy介导的母婴分离应激致认知功能障碍中的变化特征 为了明确 MS应激致大鼠认知功能障碍过程中，升高的 Hcy对 mtDNA 6mA修饰的影响，观察 mtDNA 6mA 在该病理过程中的变化特征。提取大鼠海马组织线粒体及 mtDNA，采用实时荧光定量 PCR（q-PCR）检测大鼠海马组织 mtDNA拷贝数及其编码基因的转录水平；采用蛋白免疫印迹实验（Western Blot，WB）检测海马组织线粒体内 mtDNA 编码基因的蛋白表达水平以及甲基转移相关酶（甲基化酶 METTL4 和去甲基化酶 ALKBH1 ）的蛋白表达水平；采用点杂交（Dotblot）实验检测海马 mtDNA 6mA修饰水平；采用 6mA-DNA免疫共沉淀技术（6mA-MeDIP）检测 mtDNA 非编码区（D-Loop 区）重链和编码基因的 6mA修饰水平。结果显示 MS 应激大鼠海马 mtDNA 拷贝数减少，编码基因 ND1、ND2、ND4L、COX1和 COX3的表达明显下调；线粒体转甲基酶 METTL4表达上调，去甲基化酶 ALKBH1表达下调；Dotblot结果显示 mtDNA 总 6mA修饰水平升高，MeDIP结果表明 D-Loop区重链启动子（HSP）上 HSP-5和 HSP-1两个位点6mA修饰水平显著升高，HSP-2位点6mA修饰水平降低；mtDNA编码基因ND2、COX1、COX2、ATP6 的 6mA 修饰水平增加。而下调 Hcy 后模型大鼠mtDNA拷贝数及其编码基因 ND1、ND2、ATP6、COX1和 COX2的表达升高；线粒体内甲基转移酶 METTL4 表达降低，去甲基化酶 ALKBH1 表达增加， mtDNA总6mA修饰水平降低；HSP-5和HSP-1位点以及ND2、COX2的6mA修饰水平降低显著降低，而 HSP-2无改变，COX1和 ATP6仅有降低趋势。同时细胞实验结果显示，100μM Hcy干预原代神经元24 h和48 h mtDNA拷贝数及其编码基因的表达降低，METTL4 表达水平和 mtDNA 6mA 修饰水平明显增加；而PC12细胞干预 24 h后 mtDNA拷贝数及其编码基因的表达显著升高，干预 48 h后降低，METTL4表达水平和 mtDNA 6mA修饰水平随着干预时程延长出现先降低后升高的趋势。以上结果提示， Hcy通过调节 mtDNA 6mA修饰水平介导 MS应激大鼠mtDNA拷贝数和编码基因表达的降低。 第三章 mtDNA 6mA修饰对线粒体功能的调控机制研究 为了进一步明确 mtDNA 6mA 修饰在母婴分离应激致大鼠认知功能障碍和线粒体损伤中的作用。采用 MS 应激模式建立应激致认知功能障碍大鼠模型，采用脑立体定位技术对大鼠海马注射干扰METTL4腺相关病毒（shMETTL4-AAV），建立 Con+scramble、Con+shMETTL4、MS+scramble、MS+shMETTL4 四个实验分组；通过行为学实验检测大鼠认知功能的变化；使用 ELISA试剂盒检测大鼠血浆及海马组织Hcy水平；采用ATP/MMP试剂盒检测线粒体膜电位和ATP产生；采用 O2K 检测线粒体呼吸功能和复合体活性；采用 q-PCR 检测大鼠海马组织mtDNA拷贝数及其编码基因的转录水平；采用 WB检测海马组织线粒体 mtDNA编码基因的蛋白表达水平以及 6mA 甲基转移相关酶的蛋白表达水平；采用Dotblot实验和免疫荧光染色检测海马 mtDNA 6mA修饰水平及分布；采用 6mA-MeDIP实验检测 mtDNA D-Loop区和编码基因的 6mA修饰水平；采用染色质免疫沉淀实验（ ChIP ）检测转录因子 TFAM 与 mtDNA 的结合。结果显示干扰METTL4大鼠海马和线粒体内 METTL4蛋白表达均明显降低，mtDNA 6mA总甲基化水平下降；进一步，mtDNA D-Loop 区重链 HSP-1 和 HSP-5 两个位点以及mtDNA 编码基因 ND2、COX1、COX2 的 6mA 修饰水平明显降低，HSP-2 无改变， ATP6仅有降低趋势；与 MS组相比，下调 mtDNA 6mA修饰水平改善了线粒体呼吸链复合体 I、IV的呼吸功能和大鼠空间学习记忆能力，增加了 MS 大鼠mtDNA拷贝数及编码基因ND1、ATP6、COX1、COX2的表达；但干扰METTL4不影响对照组和 MS组大鼠血浆和海马 Hcy水平。此外，与 Con组相比，MS应激显著抑制大鼠TFAM与mtDNA HSP1号和5号位点的结合，Hcy下调可以恢复TFAM的结合。因此，以上结果提示，TFAM作为 mtDNA 6mA修饰的下游调控机制，在 Hcy介导的 MS应激致大鼠认知功能障碍和线粒体功能损伤程中发挥重要的调控作用。 综上所述，升MS应激导致血浆和海马组织Hcy水平升高，通过增加mtDNA 6mA 修饰水平，抑制转录因子 TFAM 与 mtDNA 重链启动子的结合，干扰mtDNA拷贝数及其编码基因的表达，损伤线粒体功能，进而诱导大鼠认知功能障碍。
NETL