摘要
紫花苜蓿（Medicago sativa）是优质豆科草本植物，但木质素含量过高会影响紫花苜蓿消化率。目前，我国商业化低木质素紫花苜蓿优质品种比较匮乏，而定点基因编辑技术可以针对特定性状品质进行改良，加速低木质素紫花苜蓿优质品种的选育。本研究通过分析紫花苜蓿木质素合成关键基因CCR及其表达模式，利用CRISPR/Cas9技术定点编辑MsCCR4与MsCCR7，获得了msccr4和msccr7突变体材料，为低木质素紫花苜蓿品质改良提供参考。主要结果如下： 1、在全基因组水平鉴定出23个MsCCR基因。MsCCR4与MsCCR7基因的进化关系和氨基酸序列同源性分别与拟南芥木质素合成关键基因 AtCCR1 和AtCCR2 高度类似。通过 qRT-PCR 分析表明 MsCCR4 在茎的相对表达量最高， MsCCR7在茎与花中相对表达量较高，与木质素分布特征相一致。 2、初步获得 MsCCR4 与 MsCCR7 基因编辑的突变体植株。对 MsCCR4 与MsCCR7 基因及其同源基因的保守区域设计了 2 个 sgRNA，构建了能同时定点敲除MsCCR1/3/4/5与MsCCR7/11/14基因的CRISPR/Cas9表达载体。获得243株MsCCR4阳性植株，编辑率为43.6%。获得36株MsCCR7阳性植株，编辑率为 25%。选取 10 株 msccr4 和 5 株 msccr7 突变体植株进行脱靶率检测发现， msccr4存在一处脱靶，结果为一个A碱基的缺失，msccr7突变植株未发现脱靶现象。 3、分析了突变体木质素含量、茎组织化学染色与品质性状。在突变体植株到达现蕾期后对茎木质素含量测定发现，与野生型木质素含量相比，42株msccr4突变体植株中有24株的木质素含量显著降低，且有3株msccr7突变体植株较野生型木质素含量出现显著降低。地上部分进行木质素含量与茎中测定结果趋势一致。随后对突变体的茎横切面进行组织化学染色，发现突变体的木质部细胞层数较野生型降低了1-2层。msccr4突变体中有20株粗蛋白含量与相对饲喂价值显著提高，msccr7 突变体中有 4株粗蛋白含量和3 株相对饲喂价值显著提高，说明降低木质素含量会影响紫花苜蓿的品质性状。 4、突变体植株响应干旱胁迫分析。对苗期突变体植株进行干旱胁迫后，msccr4_96与msccr7_43的MDA含量与SOD酶活性与野生型无显著差异。说明通过基因编辑技术可以改良紫花苜蓿品质但不影响其耐旱性，为后续通过基因编辑改良紫花苜蓿品质提供了借鉴。
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