摘要
缢蛏（Sinonovacula constricta）属帘蛤目（Veneroida）竹蛏科（Solenida），是生活在我国沿海潮间带的重要经济养殖贝类之一。近年来，受到气候变化及自然灾害的影响，潮间带的海水盐度波动幅度大大增加。由于缢蛏等双壳贝类的移动性较差，海水盐度频繁变化会使贝类面临发育迟缓、生理紊乱甚至大规模死亡的威胁。因此提高缢蛏耐盐性能在个体生长发育和生存繁殖过程中尤为重要。 高盐会首先引起渗透调节失衡，脯氨酸则作为游离氨基酸之一参与到应答渗透胁迫的过程中，脯氨酸代谢能够帮助机体适应高盐，改善机体在高盐胁迫时的生存生理情况，提高机体对盐度的耐受性。由于脯氨酸合成涉及多种还原酶，如 P5CS 和 P5CR 等，这些还原酶发挥其功能时，往往需要 NADP(H) 提供还原力，因此脯氨酸能否正常合成积累就依赖于 NADP(H) 池的充盈度。在生物体内，NAD 激酶（NADK）是唯一能够催化 NAD(H) 磷酸化生成 NADP(H) 的关键酶，且 NADK 与机体抵御逆境胁迫的能力有着紧密联系。因此，探究NADK 与脯氨酸代谢之间的关系可能有助于提高机体抗性。然而，目前有关海洋贝类在胁迫条件下脯氨酸代谢分子机制的研究较少，关于调控脯氨酸合成的上游尚无明确报道。 本文首先从鳃组织形态学和氧化应激状态等方面分析了脯氨酸在高盐胁迫条件下对缢蛏耐盐性的影响；基于系统进化关系和时空表达模式等信息，结合RNAi技术，研究了NADK对脯氨酸合成通路的调控作用，揭示了NADK调控脯氨酸合成的分子机制，及其增强缢蛏耐高盐性能的重要作用。 1. 明确了脯氨酸对高盐下缢蛏鳃组织结构的影响及其在氧化应激方面发挥的作用。利用组织切片技术对缢蛏的鳃组织形态进行分析，发现高盐胁迫会导致缢蛏鳃组织出现皱缩，鳃丝变短，96 h 时长度和宽度约缩短为对照组的 40%，而外源脯氨酸的添加能够缓解鳃组织的病理损伤，鳃丝最大伸长为对照组的 1.5倍，增大了与水体的接触面积。进一步的研究显示，缢蛏鳃中的胶原蛋白会在高盐胁迫下分解，这导致了鳃结构的破损，而脯氨酸能够使胶原蛋白沉积，其面积占比达到 12.93±1.34%，与对照组呈显著差异，说明外源脯氨酸能够增强鳃组织在高盐胁迫下的稳定性，从而使鳃组织发挥其正常的生理功能。通过氧化应激指标确定了高盐下缢蛏抗氧化系统被激活，胁迫诱导了缢蛏的氧化应激，脯氨酸显著提高缢蛏机体对高盐的耐受性和免疫能力。脯氨酸充足的情况下， NAD+/NADH比值在胁迫后期增长至对照组的1.3倍，这为细胞正常供能提供能量基础。 2. 阐明了缢蛏NADK基因的表达特征及其在高盐胁迫下的应答情况。从缢蛏的高盐转录组数据库中获取 ScNADK 基因序列，对其进行序列验证和分析。通过比较氨基酸序列和构建系统进化树等方式，确定了 NADK 序列结构域及其在进化上的高度保守性。此外，通过qRT-PCR技术分析了ScNADK在缢蛏成体中的表达谱，NADK 在组织中广泛表达，高盐胁迫下 NADK 在缢蛏鳃组织中呈现显著高表达，约为正常条件下的4倍。在胁迫0、3、6、12、24、48、72h时检测鳃组织中NADK相对表达量，结果显示在高盐环境下ScNADK的表达水平显著升高，在 12h 达到峰值，随后下降，在 72h 时的表达量与对照组无显著差异，说明缢蛏在面对高盐胁迫时，尤其是在胁迫的早期阶段，可通过上调NADK表达提高应对盐度变化的能力。 3. 揭示了 ScNADK调控脯氨酸合成过程及其提高缢蛏耐盐性的功能。利用RNAi技术敲降了NADK在缢蛏体内的相对转录水平，NADK低表达导致缢蛏鳃组织中脯氨酸含量显著下降，与对照组相比减少了45%；在mRNA水平上，敲低NADK影响了脯氨酸合成通路关键基因P5CS、P5CR和OAT的表达，与高盐胁迫组相比，敲低后 P5CS 的相对表达量减少了 88%，P5CR 的表达量减少了17%，表明 ScNADK 主要通过谷氨酸途径介导脯氨酸合成。然而，敲低 NADK使OAT水平显著上升，这说明当ScNADK介导的谷氨酸途径被抑制时，鸟氨酸则成为主要前体物质支持脯氨酸合成。同时，高盐胁迫下鳃细胞活力为 28%，外源脯氨酸充足时鳃细胞活力提高至 77%，证实了 NADK 介导脯氨酸合成有助于提高盐度胁迫时鳃细胞的生理状况，并有效抑制胁迫时鳃细胞凋亡的发生，表明NADK介导的脯氨酸合成能够提高缢蛏耐受高盐环境的性能。 综上，脯氨酸有助于提高缢蛏对盐度的耐受性，缢蛏体内积累足够的脯氨酸能够减少鳃的损伤情况，且维持机体氧化还原的平衡状态。缢蛏 NADK 在应答高盐胁迫时发挥重要作用，通过调控脯氨酸的主要合成途径——谷氨酸循环，影响脯氨酸的积累过程。ScNADK 介导的脯氨酸合成维持着鳃细胞良好的生理状态。该研究结果为双壳贝类选育耐高盐品种提供了分子基础。
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