摘要
全球气候变化引起的极端温度事件出现的越来越频繁，而鱼类作为变温动物，周围温度的改变对其产生着至关重要的作用。低温胁迫直接影响着水生生物的生理活动和生长发育，极端情况下可能导致大量死亡。充分理解低温胁迫对于确保水产养殖业的稳定发展至关重要。斑马鱼（Danio rerio）作为硬骨鱼类，性成熟周期短，全年产卵的特点使其成为了研究鱼类良好的模式生物。本研究将成年的斑马鱼分别置于 27℃（正常温度）、18℃（低温）、13℃（寒冷）的梯度低温下暴露 30 天。然后，对不同温度下斑马鱼的脑组织进行了 TMT 定量蛋白组学、磷酸化定量蛋白组学和转录组学的分析研究。结果发现，不同温度下处理的斑马鱼蛋白表达水平、磷酸化修饰水平和转录水平有着明显的差异。在蛋白组中通过对差异蛋白的筛选，我们发现有 316个蛋白发生显著上调，有 496个蛋白发生显著下调，其中有 2 个蛋白在三组的互相比较中共同上调，4 个蛋白在三组的比较中共同下调。在磷酸化蛋白组中有 1586 个肽段的磷酸化修饰水平显著上调，有1328个肽段的磷酸化水平显著下调。在转录组中有 2305个基因的转录水平显著上调， 1956 个基因的转录水平显著下调。然后，我们对差异蛋白进行GESA 富集分析，富集到了一些具有显著性（pvalue＜0.05）的代谢通路，包括与细胞膜组成有关的，例如鞘脂类物质分解代谢通路（sphingolipid catabolic process）和膜脂质分解代谢过程（Membrane lipid catabolic process）以及与离子运输相关的，例如钙离子依赖性外泌作用的调节（regulation of calcium ion-dependent exocytosis）和跨质膜钾离子输入（Potassium ion import across the plasma membrane），重要的是，我们定位到了两个与低温有着密切关系的通路，分别是响应低温代谢通路（response to cold）和含吲哚复合物代谢通路（indole-containing compound metabolic process）。响应低温代谢通路中发生显著性变化的三种蛋白分别是HMGB1a、GRINAa和CIRBPb。 通过对转录水平和磷酸化水平的检查，我们重点关注到了 HMGB1a 及其同家族蛋白HMGB3a。HMGB家族被人们所熟知的功能主要有：参与 DNA 的转录、重组和修复；诱导细胞释放促炎因子，引起炎症反应。在我们的研究中， HMGB1a 和 HMGB3a 蛋白的表达水平在低温下显著上升。同时，利用定量磷酸化蛋白组学揭示蛋白质在磷酸化水平的变化。结果显示， HMGB1a 和 HMGB3a肽段在磷酸化修饰上都有着上调的趋势，HMGB3a变化尤其显著。紧接着，我们探究 HMGB1a和 HMGB3a在转录水平上的变化，二者在低温胁迫下转录水平显著升高。由此确定低温会显著影响 HMGB 家族在蛋白水平和基因水平上的变化，使其表达量上升。而另一条代谢通路：含吲哚复合物代谢通路中有显著性变化的四种蛋白分别是 AFMID、TPH2、ASMT 和 ASMT2,这四种蛋白随着温度降低都有着显著下调的趋势。在功能方面，四者都是参与色氨酸代谢的关键酶。色氨酸在真核生物中主要有三条去路：1.作为蛋白质合成的原料；2.参与犬尿氨酸代谢途径；3.进入 5-羟色胺代谢途径合成褪黑素。而这四种蛋白的其中三者（TPH2、ASMT 和 ASMT2）是褪黑素合成途径中的关键酶。色氨酸羟化酶 2 （TPH2）能够将色氨酸转化为 5-羟色胺，而乙酰色胺 O-甲基转移酶（ASMT、ASMT2）则是负责催化血清素转化为褪黑素最后一步反应的酶。三者在低温下显著下调代表褪黑素的合成途径被抑制。褪黑素在调节生物体昼夜节律、参与抗氧化方面被熟知。然后，我们利用靶向代谢组学研究低温胁迫下斑马鱼大脑中总褪黑素的含量究竟如何变化。结果发现色氨酸、5-羟基吲哚-3-乙酸（5-羟色胺的主要代谢产物）和褪黑素在低温下显著下调。蛋白组学和靶向代谢组学的结果证明了低温胁迫下，斑马鱼的大脑中褪黑素的合成途径被抑制，最终导致了褪黑素含量降低。在以往的研究中，褪黑素与温度确实有着密切的关系，在金鱼、虹鳟和梭子鱼中褪黑素的含量与温度呈正相关。而在多种植物的研究中发现，褪黑素可能通过维持生物体氧化还原状态的平衡从而提高植物的耐寒性。这为我们在水产养殖渔业中有效应对低温环境提供了有益的参考。 综上，我们利用了定量蛋白组学结合靶向代谢组学以及定量磷酸化蛋白组学和转录组学，发现了斑马鱼对低温响应的两个关键通路和关键蛋白。结合数据分析，结果暗示褪黑素、HMGB1a 和 HMGB3a 可能与斑马鱼的低温耐受过程有关。这项研究或许会对提高鱼类温度耐受范围，帮助水产养殖渔业减小极端寒冷事件带来的损失提供理论依据。
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