摘要
随着细胞与基因疗法的市场愈发火热，基因治疗领域中最常用的载体AAV、慢病毒和mRNA疫苗的生产都需要质粒作为重要的制药原材料，其市场需求日益强劲。因此需要对商业化质粒生产工艺进一步的优化，以期满足临床与商业端的质粒需求。本文主要从商业实际问题出发，基于QbD理念重新梳理了质粒商业化生产整个流程和控制，以大肠杆菌为宿主菌株，通过生产工艺的研发和优化，制备出符合各项要求的标准质粒。主要研究内容和结果如下: （1）在上游发酵工艺中以LB为种子培养基，改进LB培养基为发酵培养基;一级种子扩培，4±1％接种比进行发酵，以甘油为碳源，采用连续补料方式进行补料。从发酵3.5 h时开始补料，补料流速为4～5 g/kg/.H,发酵5.5 h时调整补料速度为8～10g//kg/H至发酵结束;采取以37.0±1.0℃为发酵温度;pH控制范围为7.2±0.5;DO≥20％;发酵14土 2h时停止补料。 （2）下游纯化工艺中，菌体收集采用切向流超滤工艺，选用500Kda PES材质的中空纤维对菌体进行浓缩，通过洗滤工艺将菌体置换到裂解液Ⅰ中，控制固液比为60-240 g/L，然后加入2倍体积裂解液Ⅱ和1.5倍体积裂解液Ⅲ，控制碱裂解搅拌转速在100-150rpm;裂解结束后采用50 μm和0.6 μm两级滤器对碱裂解液进行澄清。 （3）下游纯化工艺采用经典三步层析法，分子筛层析选用6FastFlow填料，上样20-35％柱体积以去除RNA并进行彻底换液;在2M硫酸铵条件下超螺旋质粒结合到Plsmidselect亲和填料上，去除线性和开环质粒，提高超螺旋比例;最后选用Source30Q阴离子交换层析，进行精纯，进一步提高质粒质量，并降低内毒素、宿主蛋白及宿主DNA残留水平。 综上所述，本研究通过对上游发酵工艺控制，尽可能使生物量与质粒拷贝数乘积最大化，从而给后续工序提供充足的输入原料。通过碱裂解工艺各条件的控制，提高超螺旋质粒产率，同时尽可能减少其他杂质含量。最后通过三步层析，锁定工艺参数，得到了符合质量要求的的质粒载体。
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