摘要
目的： 胃癌的发生及进展过程具有高度异质性，驱动其发展及转移的关键性基因突变和表观遗传异常十分繁杂。对胃癌进行精准的分型，是进行靶向治疗必须克服的重大障碍。研究者们通过对胃癌大规模的组学队列研究将胃癌的分型推进到了分子分型水平。分子分型的基础是通过组学技术对胃癌的分子病理进行大规模研究。相较于传统的组织病理学分型，分子分型能够相对准确的指导诊断及靶向治疗。然而，实现胃癌的精准医疗仍然需要更加深层的指导方案，即在分子分型的基础上提出更加确切的分子标志物，用于靶向治疗或疾病诊断，从而直接将胃癌的分型与靶向诊断、治疗相关联。本论文在研究一中，试图鉴定在胃癌分子分型中是否存在特异性的信号通路激活。在研究一中，本文通过文献提出了EBV亚型中是否存在相对其他亚型更高的WNT信号通路激活的假设。因此研究一的具体目的是鉴定EBV亚型是否相对其他亚型存在更强的特异性WNT通路激活,并研究其转录因子以及其调控的下游基因，从而提出EBV亚型的特异性标志物及潜在靶点；在研究二中，本文试图鉴定胃癌分子分型中不同亚型的突变特征，并探究突变特征与驱动突变以及肿瘤预后的关系，以期通过提炼突变特征提出胃癌分子分型下精准诊断与治疗的新策略。 方法： 1. 研究一方法：（1）在公共数据库GEO中下载获取胃癌RNA-Seq数据，通过对比爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）阳性和EBV阴性细胞系的RNA-Seq进行差异基因的比较，总结EBV高表达基因集；通过GDC以及Cbioportal端下载TCGA胃腺癌队列的RNA-Seq数据，应用TSNE降维分析验证EBV高表达基因集的特异性；然后对EBV亚型的特异性基因集进行通路富集分析确定其特殊的信号通路；（2）体外实验中通过对EBV+的胃癌细胞系添加XAV939特异性抑制WNT信号通路，然后应用划痕伤口愈合试验、Transwell穿孔试验等检测细胞增殖、迁移及侵袭的能力。从而探究WNT信号通路对EBV阳性胃癌细胞的作用；此外，通过RT-PCR以及Westernblot实验探究了抑制WNT信号通路后EBV阳性胃癌细胞中调控EMT的关键基因如CDH1、CDH2及转录因子TWIST1 和 SNAI的改变；（3）获取了胃癌chIP-seq数据（GSE164223），通过对EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性细胞系抗H3K27ac Chip-Seq进行差异峰比较，总结EBV感染胃癌的特异性启动增强子；通过对增强子的DNA序列进行转录因子的富集，推测EBV阳性胃癌中潜在的活性转录因子并探究是否与WNT通路有关；依据胃癌中潜在的活性转录因子的基因表达进行分组，对应GDC数据库中胃癌临床样本数据中对TCF7L2和KLF5高表达对于胃癌生存的影响分析；对31例临床EBV阳性胃癌样本，通过多级模型结合的线性回归，探究胃癌中潜在的活性转录因子在临床样本的表达以及它们和转移发生率的关系；（4）GSA组学原始数据库获取EBV阳性胃癌单细胞基因表达，对其进行共表达网络分析，探究EBV阳性胃癌细胞是否存在与WNT信号通路有关的共表达网络；验证EBV阳性单细胞对于WNT信号通路是否存在异质性；进一步对EBV阳性胃癌单细胞进行拟时间分析，探究WNT信号通路在EBV阳性胃癌单细胞进展中的作用。 2. 研究二方法：（1）通过重分析全基因组测序数据获得TCGA胃腺癌队列的体细胞突变；通过非负矩阵分解法（NFM）对TCGA胃腺癌队列的样本进行突变特征的分解，从而比较归纳不同亚型的突变特征；通过突变特征对TCGA胃腺癌队列的样本行PCA分析，从而比较胃癌的TCGA分子分型中四个亚型的突变特征是否存在显著差异；（2）通过获取TCGA胃腺癌队列中MSI事件的统计，探究其与DNA修复缺失性突变特征（dMMR）的关系；（3）通过MutsigCV与OncodriveCluster鉴定胃癌中显著的驱动基因，然后通过贝叶斯统计方法估计不同胃癌驱动基因突变的突变特征成分，比较胃癌不同突变特征对不同亚型胃癌的驱动基因突变是否存在偏好。（4）比较不同突变特征与临床预后的关系，基于突变特征构建预测模型，通过R中的MASS软件应用二次判别分析（QDA）进行机器学习，提出胃癌分子分型分类和预测的新模型。 结果： 1.研究一结果：（1）本研究成功获取了EBV阳性胃癌相比EBV阴性细胞系的特异性高表达基因集；并通过通路富集分析研究发现，EBV阳性胃癌细胞高表达基因集显著富集于WNT信号通路；随后通过典型WNT信号通路介导分子CNTTB1，典型WNT信号通路受体LRP5，典型信号通路转录因子TCF7L2的高表达，我们进一步确认EBV阳性胃癌中的WNT信号激活为典型WNT信号通路；（2）体外应用细胞克隆、划痕和Transwell实验证实，对EBV阳性胃癌细胞进行WNT信号通路的抑制后，胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力被减弱下降。此外，本研究通过基因和蛋白水平鉴定了WNT信号通路在EBV胃癌细胞中对EMT基因表达的调控；应用WNT信号通路抑制剂XAV939的处理后，RT-PCR以及Westernblot检测胃癌细胞调控EMT关键基因，CDH1的表达水平增加，CDH2的表达水平显著减少，转录因子如TWIST1和 SNAI的细胞表达水平表达降低，MMP9 水平显著下调。（3）本研究获取了EBV阳性胃癌相比EBV阴性细胞系的特异性增强子；通过转录因子基序富集分析鉴定了TCF7L2和KLF5的显著富集。生存分析表明TCF7L2的高表达与较差的预后有关；对胃癌样本的基因表达水平与转移率的回归分析证明TCF7L2与KLF5具有协同性的增加转移的风险；（4）通过EBV阳性胃癌单细胞基因表达本研究确认了与典型WNT信号通路高度相关的共表达网络，并进一步证实WNT信号通路激活在EBV阳性胃癌细胞中存在异质性；通过对WNT信号通路激活亚群的单细胞进行拟时间分析，研究发现KLF5可能是肿瘤干细胞调控因子，它与TCF7L2协同调控肿瘤细胞的EMT变化。 2. 研究二结果：（1）在本研究中，我们对胃癌TCGA亚型中的突变特征进行了识别和分解，发现四种胃癌亚型的突变特征是异质的，不同的亚型呈现出了与其各自特殊病理因素相关的突变特征，尤其是MSI 亚型与其他三种亚型相比具有明显的差异，这主要是由于他们特异性的含有错配修复缺陷（dMMR）特征signature15、20、21 和 26所导致的。（2）发现了错配修复缺陷特征的存在增加了MSI事件的数量并且与dMMR特征的强度正相关，此外构成高突变负荷来源的特征1和15的突变数量与PD-L1的表达正相关，暗示免疫治疗的可能性收益，也证实了突变负荷与年龄有关的突变特征相关。（3）研究发现，突变特征不对称地沉积到不同胃癌亚型的驱动基因中具有明显的偏好性。例如TP53的突变主要是由老化特征signature 1和 错配修复缺陷突变特征signature 15造成的等等。（4）证实了突变特征具有临床相关性，较高的错配修复缺陷突变特征的叠加预示了较好的预后，而突变特征17和18叠加与较差的预后有关，此外，我们利用突变特征的特征碱基替换类型，加上CDH1和PIK3CA的非沉默突变，构建了一个可以有效地区分和预测胃癌TCGA 分子亚型的机器学习模型，对四种亚型分型的平均精准度为0.89，召回率为0.78。 结论： 在第一项研究中，我们通过基因表达揭示了TCGA分子分型中EBV亚型的特异性WNT信号通路激活，它们会上调典型的WNT信号传导介质 CTNNB1和受体LRP5的基因表达。并且WNT 信号传导功能参与调节 EBV+ 胃癌中的上皮-间质转化(EMT)，EBV+增强子的转录因子基序（motif）的富集表明TCF7L2为WNT激活的下游转录因子，其表达与临床上较差的生存率和更高的转移有关。我们还发现KLF5可能作为肿瘤干细胞的关键转录因子对TCF7L2的功能起到强化作用。该研究我们通过对胃癌的基因表达通路研究，鉴定并证实了经典WNT信号通路在EBV亚型中的特异性激活，还证实了WNT信号通路通过WNT/CTNNB1/TCF7L2轴在EBV中调控EMT基因的表达。 在第二项研究中，我们通过体细胞突变较为全面地解析了四种胃癌TCGA亚型中的突变特征成分，发现了不同亚型突变特征的异质性，尤其是MSI亚型相比其他亚型明显特异性并揭示了其独特的错配修复缺陷（dMMR）突变特征，而且量化证实了dMMR突变特征与肿瘤的MSI事件相关以及它对PD-L1表达和免疫细胞浸润的影响。发现突变特征可用于暗示 MSI 事件、PD-L1 治疗潜力和生存期。此外，研究中还总结了突变特征在不同胃癌亚型的驱动基因中有明显的偏好性。最后，本研究基于突变特征进行了生存分析并提出了有效的预测模型。 总的来说，在TCGA分子分型的框架中，通过组学方法，对胃癌的不同亚型进行研究，揭示不同亚型的分子模型，有利于为胃癌进行精准靶向治疗提供依据。
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