摘要
三角鲂（Megalobrama terminalis）隶属于鲤形目（Cypriniformes）、鲤科（Cyprinidae）、鲂属（Megalobrama），俗称鳊鱼，是我国重要的淡水经济养殖品种。三角鲂具有肉质鲜美、生长速度快和成活率高等优点，已陆续推广到全国各地，其养殖规模不断扩大。在养殖中发现，初次性成熟的亲本性腺发育质量差，怀卵量少，这使得其受精率和孵化率相对较低，限制了三角鲂产业的规模化繁育进程。此外，关于三角鲂性腺发育的研究较少，性腺发育基因调控机制尚不明晰，有待进一步解析。因此，本研究以三角鲂为研究对象，利用转录组和蛋白组学关联分析，探索不同发育时期三角鲂雌雄亲本关键差异表达基因、蛋白及重要信号通路在生殖发育中的功能；探究关键基因 foxl2 在三角鲂性腺发育中的表达调控模式；筛选出适宜的促进亲本性腺发育的饲料添加剂，研究结果将为三角鲂性腺发育调控机制解析及高效繁育提供基础资料。主要结果如下： （1）为阐明三角鲂性腺发育调控机制，选取三角鲂不同发育（未成熟, S组;成熟, B 组）时期性腺（卵巢, Ov;精巢, Te）进行转录组分析。火山图结果显示， Ov-S 与 Ov-B 之间有 2982 个 DEGs（其中 1094 个上调, 1888 个下调），Te-S 与Te-B之间有4338个 DEGs（其中 3176个上调, 1162个下调），Te-S与 Ov-S之间有14757个DEGs（其中5966个上调, 8791个下调），Te-B与Ov-B之间有15553个DEGs（其中4676个上调, 10877个下调）。进一步以|log2FC|＞2且q-value＜0.05为筛选条件，共筛选出 71个性腺发育相关基因，这些基因主要富集在“类固醇激素生物合成”、“卵巢类固醇生成”和“催乳素信号通路”等 KEGG 通路中。通过qRT-PCR对转录组中10个DEGs（piwil1、sox30、cyp26a1、zp3、hormad1、rec8、dmrt1、wt1a、bmp15和ctnnb1）进行了表达量分析，验证了RNA-Seq测序结果的准确性。 （2）为进一步揭示三角鲂性腺发育调控机制，采用 DIA 定量蛋白质组学对不同发育时期性腺表达蛋白进行定性和定量研究。对各组样品进行两两差异表达分析，Ov-S与 Ov-B之间有 2466个 DEPs（其中 987个上调, 1479个下调），Te-S与 Te-B之间有 3351个 DEPs（其中 1898个上调, 1453个下调），在 Te-S与 Ov-S之间有 3108个 DEPs（其中 1555个上调, 1553个下调），在 Te-B与 Ov-B之间有3271 个 DEPs（其中 1411 个上调, 1860 个下调）。以|log2FC|＞1 且 q-value＜0.05 为 筛选条件，共筛选出 12 个性腺发育关键蛋白，这些蛋白主要富集在“类固醇激素生物合成”、“卵巢类固醇生成”和“皮质醇的合成和分泌”等通路中。通过转录组和蛋白组学关联分析发现，71个 DEGs 与 12个 DEPs 中有 11 个重叠基因（piwil1、piwil2、cyp11a1、zp2、zp3、zp4、ctnnb1、aldh1a2、hsd17b8、ddx5、inha），涉及 2 个重叠通路（“类固醇激素生物合成”和“卵巢类固醇生成”），结果表明类固醇生成途径是三角鲂性腺发育的关键调控通路。 （3）foxl2 不仅是三角鲂性腺发育关键基因，还参与其关键调控通路类固醇的生成，因此对该基因进行克隆及表达特征分析。foxl2 基因 ORF 为 921 bp，共编码 306个氨基酸，具有保守的叉头（Forkhead, FH）结构域，与斑马鱼（Danio rerio）FOXL2的同源性较高达到96%。qRT-PCR结果显示，foxl2 mRNA在24 hpf （hour post-fertilization）、48 hpf和60 hpf表达量较高（P＜0.05）；在卵巢中的表达量显著高于精巢和其他组织（P＜0.05），表达具有组织特异性。腹腔注射 17ɑ-乙炔基雌二醇（17ɑ-ethynylestradiol, EE2）对三角鲂 foxl2 mRNA表达调控结果显示， foxl2 在雌鱼脑组织中的表达量达到峰值且显著高于对照组和雄鱼（P＜0.05）；foxl2 在 24 h 后的卵巢和精巢中表达量最高，且在 36 h 的卵巢中持续高表达（P＜0.05），表明 EE2 能够明显促进三角鲂脑和卵巢 foxl2 mRNA 的表达，说明foxl2可能是与性类固醇激素相互作用来调节三角鲂性腺发育和功能维持。 （4）为筛选获得促进三角鲂亲本性腺发育的饲料添加剂，本研究采用不同浓度维生素E（VE）和淫羊藿对初次性成熟的三角鲂进行投喂。养殖实验结果表明，经过 50 d 养殖，相比对照组，VE 和淫羊藿均能促进三角鲂亲本性腺指数（GSI）提高，其中500 mg/kg VE和4%淫羊藿组效果最佳，GSI分别提高了12.20%和 9.25%；组织学结果显示，精巢大量成熟精子释放至小叶腔，卵巢卵母细胞呈圆形，核膜部分溶解，核仁逐渐消失；ELISA 结果显示，雌二醇（E2）、孕酮（P）、睾酮（T）和促性腺激素（Gn）4种性激素浓度随VE和淫羊藿的浓度增加而增加；繁殖结果显示，相比对照组，4%淫羊藿（♂）×500 mg/kg VE（♀）组的受精率和孵化率最高，分别显著提高11.55%和11.88%（P＜0.05）。 综上，本研究鉴定了与三角鲂亲本生殖发育相关的关键基因与蛋白，探究了foxl2基因在三角鲂性腺中的表达调控模式，筛选出了适宜的促进三角鲂亲本性腺发育的饲料添加剂，为三角鲂性腺发育和亲本强化培育研究提供了理论参考。
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