摘要
细胞死亡与机体的稳态和疾病的发生密切相关，受到广泛的关注和研究。细胞死亡有多种类型，包括细胞凋亡、程序性坏死、铁死亡、细胞自噬、细胞焦亡、铜死亡等。本论文研究方向主要聚焦于程序性坏死和铁死亡抑制剂的开发。本论文分为两大部分： 第一部分是程序性坏死抑制剂的设计、合成及活性研究。 细胞程序性坏死主要受到RIPK1-RIPK3-MLKL信号通路的调控，RIPK1作为上游关键调控蛋白，抑制RIPK1可以有效抑制程序性坏死。RIPK1异常激活与炎症性疾病，移植物抗宿主病，肺部及气道疾病，神经退行性疾病以及肿瘤等疾病的发生息息相关。已有多款RIPK1抑制剂进入临床研究阶段，但药物的疗效、毒性、药代动力学以及种属差异性问题仍是RIPK1抑制剂开发中的难点。因此，开发出更加安全、有效的RIPK1激酶抑制剂，具有较高的研究价值和临床应用前景。 本论文主要目的是通过结构修饰来改善已发表的先导化合物成药性问题。Compound56具有很好的抑制程序性坏死的活性（EC50=4.8nM），但其溶解度很差（小于0.37μg/mL），严重影响后续的研究和开发。经过科学的分析，我们推测溶解度较差的原因可能是化合物结构平面性较强，亲脂性较高。我们采取了一系列优化策略，包括：（1）以饱和环替换平面的sp2芳环；（2）引入含氮杂环来降低clogP；（3）引入亲水的极性基团；（4）引入立体的螺环结构。通过充分的构效关系研究和成药性筛选，我们最终得到了候选化合物A12。化合物A12具有很好的抑制细胞程序性坏死的活性（人源HT29-EC50=2.5nM，鼠源L929-EC50=1.3nM），无种属差异性。相较于Compound56，化合物A12的溶解度有明显提升（4.7μg/mL），证实了我们优化策略的可行性。化合物A12具有良好的体外安全性，没有明显的hERG钾离子通道抑制毒性（IC50gt;30μM），在高浓度（10μM）下对主要的药物代谢酶CYP3A4/1A2/2D6亚型没有明显的抑制作用，有较低的药物-药物相互作用风险。化合物A12还具有优良的体外ADME性质，在Caco-2透膜测试中展示出高的渗透性（Papp(A-B)=35*10-6cm/s），没有明显的外排现象（ERlt;2），在人源的肝微粒体中有较好的代谢稳定性（T1/2=40min）。在大鼠药代动力学评价中，化合物A12具有中等的血浆清除率（Cl=31mL/kg/min）和口服生物利用度（F=16%）。化合物A12在TNF-α诱导的小鼠SIRS模型中表现出了优秀的治疗效果，在1mg/kg剂量下可有效延长小鼠的生存期，抑制血浆中炎症因子IL-6的释放。 第二部分是铁死亡-程序性坏死双重抑制剂的设计、合成及活性研究。 铁死亡是一种新发现的细胞死亡方式，主要特征包括细胞内铁离子浓度的升高、脂质过氧化物的升高以及内源性还原物质的缺乏。铁死亡的调控受到氨基酸代谢、脂质代谢、铁代谢的影响，与肿瘤、中枢神经系统疾病、糖尿病、缺血再灌注损伤、肝肾损伤等疾病相关。事实上，在一些复杂疾病中，可能同时存在多种细胞死亡方式。研究发现，铁死亡和程序性坏死在动物疾病模型中呈现出相互促进、相互代偿的关系。因此，设计新型铁死亡、程序性坏死双重抑制剂对于疾病的治疗预计有更好的效果。 本论文中，我们对化合物库进行了铁死亡抑制剂筛选，成功发现了苗头化合物B1（EC50=2.2μM）。为提升苗头化合物的活性，我们对其进行了初步的构效关系研究，得到了铁死亡抑制活性最好的化合物B18（EC50=0.3μM）。为了开发铁死亡、程序性坏死双重抑制剂，我们通过计算机辅助药物设计和理性设计的策略，将铁死亡抑制剂B18与早期研究的程序性坏死抑制剂PK-68进行了分子融合，得到了新型的铁死亡、程序性坏死双重抑制剂B20（抗铁死亡EC50=2.5μM；抗程序性坏死EC50=1.7μM）。通过对B20进行构象环化，我们发现了活性得到明显提升的双重抑制剂B30，其抗铁死亡活性提升了近4倍（EC50=0.70μM），抗程序性坏死活性提升了近14倍（EC50=0.12μM）。后续的机制研究表明，化合物B30通过选择性地作用于RIPK1来发挥抑制细胞程序性坏死的活性，并且通过抑制细胞内脂质ROS的生成来抑制细胞发生铁死亡。化合物B30在全身炎症反应综合征、缺血再灌注损伤、急性肾损伤动物模型中展示出了良好的治疗效果，证实了铁死亡、程序性坏死双重抑制剂在未来有广阔的临床应用价值。 综上，本论文开发了一款高效的程序性坏死（RIPK1）抑制剂，成功地解决了早期先导化合物成药性问题，有力地支持了后续的临床前毒理和药效研究；本论文也开发了一款铁死亡、程序性坏死双重抑制剂，并在多种疾病模型中进行了药效评价，为铁死亡、程序性坏死双重抑制剂的临床应用奠定了基础。
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