摘要
目的： 为探讨苍艾鼻喷剂防治上呼吸道感染的作用及机制，本课题以寒冷刺激致大鼠鼻腔黏膜免疫屏障功能低下（nasal mucosal barrier dysfunction,NMBD）模型为研究对象，从调节鼻黏膜免疫屏障功能入手，通过体内实验结合网络药理学，考察苍艾鼻喷剂的作用及相关生物学机制，以明晰苍艾鼻喷剂防治上呼吸道感染的科学内涵。 方法： 1.苍艾鼻喷剂对鼻腔黏膜免疫功能低下模型大鼠的影响 Wistar大鼠，雄雌各半，随机分为正常组（Normal组），NMBD组（以下称Model组），苍艾鼻喷剂组（以下称CABPJ组），利巴韦林组（以下称LBWL组）每组8只。正常组不予以任何刺激;将其余三组鼠置于-15℃环境中1h，再转移至25℃环境30min,循环4次，结束后正常给予水和饲料。造模结束后6h，Normal组与Model组使用0.9％生理盐水滴鼻（10ul/鼻孔），每日一次;CABPJ组使用苍艾鼻喷剂滴鼻（10ul/鼻孔），LBWL组使用利巴韦林喷雾滴鼻（10ul/鼻孔），每日一次。给药2d;第3d除正常组外其余各组大鼠复制NMBD模型，在造模结束后6h，再次给药一次。末次给药1h后，处死大鼠，取大鼠鼻腔灌洗液ELISA法检测SIgA表达。取鼻黏膜组织，采用Western blotting法和RT-PCR法检测IgA、IFN-λ蛋白及基因转录水平。 2.网络药理学与分子对接研究苍艾鼻喷剂提升鼻腔黏膜免疫功能的作用机制 通过TCMSP数据库检索苍艾鼻喷剂的关键药物成分及其靶点，采用药物相似度标准筛选，并通过UniProt转化蛋白靶点为人类基因名。利用Pubchem和Swiss Target Prediction数据库基于反向分子对接原理预测活性成分的靶点。构建“药物-活性成分-靶点”网络，使用Cytoscape和CytoNCA插件确定主要活性成分，STRING数据库辅助构建蛋白互作网络图，通过cytohubba插件筛选核心靶点。运用DAVID数据库进行GO功能和KEGG富集分析，以探索生物功能和通路。最后，通过分子对接验证关键活性成分与靶点的相互作用，采用AutoDockTools和Autodock vina软件进行模拟，并使用Pymol进行结果可视化。 3.苍艾鼻喷剂通过JAK/STAT信号通路提升鼻腔黏膜免疫功能 本部分造模及药物干预方法同上，取鼻黏膜组织，采用Western blotting法检测JAK1、STAT1、STAT2、p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2的蛋白表达，采用RT-PCR法检测JAK1、STAT1、STAT2的基因转录水平。 结果： 1.本研究通过寒冷刺激，建立NMBD大鼠模型。通过造模后Model组大鼠鼻腔灌洗液中sIga含量相比Normal显著降低，提示经寒冷刺激后，大鼠黏膜免疫效能显著降低，提示造模成功。而经过给药后，LBWL组与CABPJ组大鼠与Model大鼠相比鼻腔灌洗液中SIgA显著升高，提示经过给药后均能提高NMBD大鼠的鼻腔黏膜免疫能力。而LBWL组与CABPJ组大鼠与相比无明显差异，提示CABPJ其提高黏膜免疫效能与西药组相近，但CABPJ组其SIgA含量仍低于Normal组，提示CABPJ能有效提高鼻黏膜免疫屏障的功能。 2.在本部分的研究中，对大鼻黏膜组织中IgA和IFN-λ的蛋白表达和转录水平进行了检测。本次实验中发现在NMBD大鼠模型中，IgA和IFN-λ的蛋白表达和基因转录水平均明显降低。经过CABPJ治疗后，IgA和IFN-λ的蛋白表达和基因转录水平均有明显升高，提示CABPJ可通过上调IgA和IFN-λ的表达达到增强鼻腔黏膜免疫功能的作用。 3.本部分研究中，通过在线数据库挖掘CABPJ潜在活性成分有29种，拓扑学筛选出黄芩素(Wogonin)，异泽兰黄素(Eupatilin)，槲皮素(Quercetin)作为关键成分。经过PPI蛋白互作分析，筛选出主要作用靶点包括AKT1、CASP3、TNF、EGFR、BCL2等。GO富集分析揭示了6429个GO条目，其中涉及肽基丝氨酸磷酸化、细胞钙离子稳态、DNA结合等关键生物过程和分子活动。此外，KEGG通路富集分析识别出447条关键通路，结合前期研究选取JAK/STAT为核心信号通路。分子对接结果也显示黄芩素，异泽兰黄素，槲皮素与IFN-λ的关键靶点IFNLR1、IL10Rβ可以结合。 4.在本部分的研究中，对JAK/STAT信号通路中JAK1、STAT1、STAT2、p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2的蛋白表达进行了检测。 结果：显示，大鼠在寒冷刺激后鼻黏膜组织中p-STAT1、p-STAT2、p-JAK1的蛋白表达降低，给予CABPJ后，大鼠鼻黏膜组织中p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2的蛋白表达升高，JAK1、STAT1、STAT2的蛋白表达均无明显变化。在基因转录水平层面，大鼠在寒冷刺激后JAK1、STAT1、STAT2的基因转录水平有显著下调，给予CABPJ后，JAK1、STAT2表达无明显变化，但STAT1基因转录水平有所上调。 结论： 1.苍艾鼻喷剂可以通过上调NMBD模型大鼠鼻黏膜IgA和IFN-λ的表达，提升SIgA含量，恢复其鼻腔黏膜免疫功能。 2.分子对接结果显示黄芩素，异泽兰黄素，槲皮素与IFNLR1和IL10Rβ两个关键靶点具有结合活性。说明苍艾鼻喷剂中的黄芩素，异泽兰黄素，槲皮素可以通过IFNLR1和IL10Rβ来提升鼻腔黏膜免疫功能。 3.苍艾鼻喷剂能升高JAK1/STAT1/2信号通路中p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2的蛋白表达，与STAT1的基因转录表达，推测CABPJ能够通过促进IFN-λ表达并启动JAK-STAT信号通路，通过介导JAK1,STAT1和STAT2蛋白的磷酸化从而提高鼻腔黏膜的免疫功能。
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