摘要
支气管哮喘是一种常见的慢性呼吸道疾病，在儿童和成年人群中发病率均较高，且近年来因城市化发展迅速、空气质量恶化等因素发病率一直稳增不减。患者病情反复发作造成气道组织纤维化，病情不断加重，对患者的生活质量和身体健康产生重大影响。肠道微生物在维持肠道平衡和宿主整体健康方面发挥着重要作用，肠道菌群与胆汁酸之间的相互作用可影响疾病的发生和发展。阳和平喘颗粒是安徽中医药大学第一附属医院的院内特色中药制剂，在临床用于治疗支气管哮喘已有二十余载，取得良好疗效，课题组前期对阳和平喘颗粒制备工艺、质量控制以及PI3K/PKB、IKK/I?B/NF-?B信号通路作为阳和平喘颗粒治疗支气管哮喘的潜在作用靶点等方面有了一定研究。基于前期研究基础，本文对阳和平喘颗粒的潜在作用机制进一步探究。 目的： 基于肠道菌群和胆汁酸代谢研究阳和平喘颗粒（Yanghe Pingchuan Granules， YPG）治疗支气管哮喘大鼠的作用机制。 方法： 1. 阳和平喘颗粒对支气管哮喘大鼠的药效学研究 将48只大鼠随机分为正常组、模型组、阳和平喘颗粒低剂量组（3.69 g/kg）、阳和平喘颗粒中剂量组（7.38 g/kg）、阳和平喘颗粒高剂量组（14.76 g/kg）、地塞米松组（0.75 g/kg），每组8只。采用卵清蛋白（OVA）致敏法诱导哮喘模型，监测一般行为状态和体重的变化；检测肺泡灌洗液（BALF）中总细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的数量；检测肺组织病理学；测定BALF中IL-6、TNF-α、IL-10的含量。 2. 阳和平喘颗粒对哮喘大鼠肠道菌群和肠道屏障的影响 收集各组大鼠粪便样本，采用Illumina NovaSeq高通量测序技术进行16S rDNA测序，结合生物信息学分析大鼠菌群的组成、Alpha多样性、Beta多样性、菌群的物种差异。通过苏木精-伊红染色（Hamp;E）观察结肠组织的形态变化。 3. 阳和平喘颗粒对哮喘大鼠胆汁酸的影响 采用LC-MS/MS联用技术检测大鼠粪便中胆汁酸的含量，对胆汁酸进行主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA），测定差异胆汁酸的含量，并对各组大鼠的差异菌群和差异胆汁酸进行Spearman相关性分析。Western blot检测结肠组织中法尼醇X受体（FXR）、紧密连接蛋白1（ZO-1）蛋白的含量，检测肺组织中TGF-β1、Foxp3蛋白的表达，RT-PCR检测肺组织中ZO-1、Occludin mRNA的表达。 结果： 1. 阳和平喘颗粒对支气管哮喘大鼠的药效学研究 正常组大鼠行为活跃，精神和毛发无明显异常变化，饮食正常，体重正常增加；模型组大鼠在OVA激发后出现点头呼吸，脸部搔抓，毛发稀疏，食欲不振等症状；阳和平喘颗粒组大鼠在给药后精神状态好转，哮喘症状有所改善。模型组BALF中的总细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量显著高于正常组，阳和平喘颗粒可以降低BALF中总细胞及各炎性细胞的数量。Hamp;E染色结果显示，正常组肺组织形态正常，肺泡结构完好，支气管上皮完整，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠气道壁和气道平滑肌明显增厚，可见大量炎性细胞浸润，阳和平喘颗粒可改善肺组织病变。ELISA结果显示，与正常组相比，模型组大鼠BALF中的IL-6、TNF-α的含量显著增加、IL-10的含量显著降低；阳和平喘颗粒组可显著降低BALF中IL-6、TNF-α的含量，增加IL-10的含量。 2. 阳和平喘颗粒对哮喘大鼠肠道菌群和肠道屏障的影响 16S rDNA检测结果显示，与正常组相比，模型组大鼠肠道菌群的α多样性、丰富度增加，经给药后，肠道菌群的α多样性、丰富度向正常组回调趋势。β多样性结果显示，各组组间差异明显，哮喘大鼠的肠道菌群组成明显改变。与正常组相比，模型组大鼠的厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）丰度降低，拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度升高，阳和平喘颗粒可使肠道菌群的组成向正常组回调。 3. 阳和平喘颗粒对哮喘大鼠胆汁酸的影响 LC-MS/MS检测结果显示，与正常组相比，模型组大鼠中甘氨胆酸（GCA）、牛磺脱氧胆酸（TDCA）等11种胆汁酸的含量增加，胆酸（CA）、熊去氧胆酸（UDCA）等5种胆汁酸的含量降低。阳和平喘颗粒给药后，胆汁酸的组成向正常组回调。Spearman相关性分析， UDCA、LCA与厚壁菌门（ Firmicutes ）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）呈正相关；UDCA、LCA与拟杆菌门（Bacteroidetes）、异杆菌属（Allobaculum）、志贺氏菌属（Shigella）、CF231、SMB53呈负相关。UDCA、GUDCA与魏斯氏菌属（Weissella）呈负相关。LCA与厚壁菌门（ Firmicutes ）、瘤胃球菌属（ Ruminococcus ）、棒状杆菌属（Corynebacterium）呈正相关，与拟杆菌门（Bacteroidetes）、异杆菌属（Allobaculum）、志贺氏菌属（Shigella）、SMB53、CF231呈负相关。WB结果显示，与模型组相比，阳和平喘颗粒增加了哮喘大鼠结肠组织ZO-1蛋白的含量，改善了哮喘大鼠肠道屏障功能，增加胆汁酸受体FXR蛋白含量的表达。阳和平喘颗粒可以显著升高Foxp3蛋白、降低TGF-β1 蛋白的含量；RT-PCR结果显示，在经阳和平喘颗粒给药后可以增加ZO-1、Occludin mRNA的表达水平。 结论： 1. 阳和平喘颗粒可改善OVA诱导支气管哮喘大鼠的症状，减轻肺组织炎症，抑制炎症因子的表达。 2. 阳和平喘颗粒可以调控大鼠肠道菌群的组成，改善菌群的紊乱，维护肠道屏障功能，通过激活胆汁酸受体FXR，维持胆汁酸稳态，影响Treg细胞分化，阳和平喘颗粒增加肺组织中Foxp3的表达，减少TGF-β1的表达，增加抗炎因子IL-10的表达，保护肺部屏障，减轻肺部炎症反应。
NETL