摘要
扩展青霉（Penicillium expansum）是重要的采后病原菌，该病原除了导致果实腐烂外还会产生有害的真菌毒素。G 蛋白是真核生物中一类具有 GTP 水解酶活性的信号传导蛋白，在信号传递过程中受 G 蛋白信号调节蛋白（RGSs）的调节。尽管已有报道表明，G蛋白和RGSs蛋白对丝状真菌生长发育、次生代谢物合成和致病性具有调控作用，但是否影响 P. expansum 的这些表型仍然未知。我们前期发现， P. expansum的Gα基因PeGα3和调节基因PeRgsA和PeRgsB在培养期间和发育阶段的表达水平较高。因此，本研究以这三个基因为研究对象，在生物信息学分析的基础上，构建PeGα3、PeRgsA和PeRgsB基因缺失突变株和回补菌株，以明确这三个基因对P. expansum cAMP/PKA、MAPK和PLC信号通路、生长发育、毒素和色素合成以及致病性等方面的调控功能。主要结果如下： 1. PeGα3基因全长1364 bp，含有G-alpha保守域，不含信号肽和跨膜结构，属于不稳定性的亲水蛋白；其编码蛋白质定位于细胞膜和细胞质中。PeRgsA 和PeRgsB基因全长1077 bp和1234 bp，均含RGS保守结构域。PeRgsA不含信号肽和跨膜结构，属于不稳定性的亲水蛋白；其编码蛋白质定位于细胞核和细胞质中。PeRgsB 不含信号肽，包含 3 个跨膜结构，属于不稳定性的亲水蛋白；其编码蛋白质定位于细胞质中。 2. PeGα3、PeRgsA和PeRgsB缺失下调了cAMP/PKA、MAPK和PLC信号相关基因的表达。ΔPeGα3中cAMP/PKA信号基因AC、PkaC和PkaR的表达下调，与MAPK信号基因Kss1、Hog1和Mpk1的表达下调，Fus3的表达上调。ΔPeGα3中PLC信号基因PLC、Pkc1、Pkc2和CDPK的表达下调。ΔPeRgsA和ΔPeRgsB中AC、PkaC 和 PkaR 的表达下调；PLC、Pkc1、Pkc2 和 CDPK 的表达均下调。ΔPeRgsA中Kss1和Hog1的表达量下调，Fus3和Mpk1表达无明显差异。ΔPeRgsB中Hog1和Mpk1的表达下调，Fus3和Kss1的表达无明显差异。 3. ΔPeGα3菌落生长缓慢，菌丝分叉增多；产孢量降低，孢子变小且孢子萌发受到抑制，与孢子形成相关基因abaA、brlA、wetA和vosA的表达下调。ΔPeRgsA菌落生长缓慢，菌丝稀疏；产孢量降低，孢子萌发受到抑制，abaA、brlA、wetA和 vosA 的表达下调。ΔPeRgsB 菌落生长缓慢，菌丝分叉增多；产孢量降低，但孢子变大且萌发点增多，brlA、wetA和vosA的表达下调，abaA表达上调。PeGα3、PeRgsA和PeRgsB均调节菌株对盐胁迫、氧化胁迫和细胞壁完整性的响应。 4. PeGα3、PeRgsA和PeRgsB缺失抑制了菌株中棒曲霉素含量和色素积累量。ΔPeGα3 中与棒曲霉素合成相关的 Pat 基因表达均下调；体内和体外的毒素含量均降低。ΔPeRgsA中除PatB、PatE、PatF和PatL外，其他Pat基因的表达均下调；体内和体外的毒素含量降低。ΔPeRgsB中仅PatA、PatH、PatI、PatJ和PatK的表达量下调；体内和体外的毒素水平降低。ΔPeGα3、ΔPeRgsA和ΔPeRgsB中与色素合成相关基因Ayg1、Tryr、Arp1、Arp2和Alb1的表达下调，色素积累量减少。 5. PeGα3、PeRgsA和PeRgsB缺失抑制了菌株的致病能力。ΔPeGα3、ΔPeRgsA和ΔPeRgsB对苹果和梨果实的致病性降低。ΔPeGα3中致病因子胞外酶基因PG、PL、PE、CA、Cx和1,4-g和pH调节基因PacC的表达下调，NADPH氧化酶基因NoxA 表达上调；ΔPeRgsA 中这三类致病因子的表达均下调；ΔPeRgsB 中胞外酶基因PG、CA、Cx和1,4-g，pH调节基因PacC和NADPH氧化酶基因NoxR表达下调，而胞外酶基因PL和PE与NADPH氧化酶基因NoxA表达上调。 6. 转录组分析结果表明，ΔPeGα3 中共有 2900 个差异表达基因(DEGs)，其中1539个上调基因，1361个下调基因。ΔPeRgsB中共有2961个DEGs，其中1685个上调基因，1276 个下调基因。ΔPeGα3 和 ΔPeRgsB 差异基因显著富集在催化活性和结合活性等分子功能，碳水化合物代谢和氨基酸代谢等代谢过程，转录和翻译、膜转运和信号转导等生物过程。RT-qPCR验证结果表明，ΔPeGα3和ΔPeRgsB中一些与信号传导、生长发育、胁迫响应、次生代谢物生物合成和致病等相关基因的表达下调。 综上，PeGα3、PeRgsA和PeRgsB参与了P. expansum下游cAMP/PKA、MAPK和PLC信号通路，以及生长发育和胁迫响应的调控。PeGα3、PeRgsA和PeRgsB还可通过调节全局性调节因子、棒曲霉毒素合成基因簇基因和色素合成基因的表达，参与P. expansum的棒曲霉素和色素合成。此外，PeGα3、PeRgsA和PeRgsB可以通过调控毒力因子胞外酶基因、pH 调节因子和 NADPH 氧化酶基因的表达，参与P. expansum对果实的致病性。
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