摘要
高寒、低氧和枯草期长是青藏高原主要的生态限制因子，高原土著动物在长期适应进化过程中形成了独特的逆境适应策略。藏猪是青藏高原特殊地理环境中的地方小型猪种，长期的选择和进化，其独特的组织形态结构和生理生化特征在应对高原逆境协同进化过程中发挥着重要作用。 藏猪在低氧环境中经过长期自然选择，形成了特别发达的心肺功能和极强的低氧适应性。目前，关于藏猪适应高原低氧环境的研究主要集中在生理、生化和组织结构特征等方面，虽然在基因组水平上筛选出了一些与低氧适应相关的基因和SNPs，且在转录组水平上揭示了低氧条件下氧代谢及相关生化反应受肺组织miRNA调控，但miRNA-mRNA共表达调控网络在藏猪低氧适应机制方面并不清楚，为进一步解析藏猪适应低氧环境的分子遗传机制，开展了如下研究：（1）选择不同海拔的6月龄藏猪、约克夏猪和杜洛克猪公猪共计221头，采集血液，通过全基因组SNP芯片的方法来筛选藏猪低氧环境自然选择的基因，使用348个全基因组数据集联合分析（包括221个全基因组单核苷酸多态性芯片数据集和下载的127个全基因组序列数据集）；（2）对不同海拔迁居试验的藏猪和长白猪肺组织进行转录组（miRNA和mRNA）测序，构建基于miRNA-mRNA共表达网络，并进一步筛选验证与低氧相关的miRNA功能；（3）通过分离藏猪肺泡II型细胞（ATII）并进行低氧胁迫试验，验证肺组织转录组学分析筛选出与低氧相关的ssc-miR-141功能。根据结果在细胞水平上利用双荧光素酶报告基因系统验证PDCD4和ssc-miR-141的靶标关系。主要研究结果如下： （1）血红蛋白（HGB）、红细胞计数（RBC）和红细胞分布宽度（RDW）在高原藏猪和约克夏猪之间差异显著，HGB在藏猪中对低压缺氧反应敏感，表明藏猪具有地方藏猪的代表性特征。 （2）分析藏猪高原适应反应的高置信度遗传特征，发现藏猪基因组包含4,598个受自然选择的位点，涉及131个受自然选择基因（TCSGs）获得RALB、NBEA、LIFR、CLEC17A、PRIM2、CDH7、GK5和FAM83B 8个新候选基因，且受自然选择基因与藏猪的多个系统和器官相关。对131个TCSGs进行KEGG和GO富集分析发现藏猪心肌组织形态发生和肌肉组织中富含多个基因，表明TCSGs在多个器官中执行不同的功能。 （3）通过对不同海拔藏猪和长白猪肺脏组织mRNA差异表达分析，挖掘出809个新基因；通过对miRNA差异表达分析，在肺脏组织共获得1,630个miRNA，其中989个已知miRNA、365个已存在miRNA和276个新miRNA。 （4）对差异表达基因进行GO功能和KEGG信号通路富集分析，发现差异mRNA主要涉及细胞过程、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、PI3K-Akt等与高原低氧相关的功能及信号通路上。差异表达miRNA主要富集在Wnt信号通路、代谢通路和肝细胞癌等通路。构建了包含273个低氧差异mRNA和差异miRNA的共表达网络，发现MEF2C、AKAP6、NTRK2、MAPT和GPR146受影响尤为显著，且与miRNA存在很强的相关性。最终，筛选出了1个与低氧密切相关的miRNA，即ssc-miR-141。 （5）通过对筛选出与低氧相关的ssc-miR-141预测共获得8,649个靶基因。进行GO功能富集和KEGG通路富集分析发现ssc-miR-141的靶基因显著富集在丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路（ko04010）、自噬动物（ko04140）、细胞粘附分子（CAMs）（ko04514）和Ras信号通路（ko04014）。采用RT-qPCR对ssc-miR-141及关键靶基因表达进行验证，选择PDCD4作为ssc-miR-141的靶基因。在低氧环境下，ssc-miR-141在ATII细胞中的表达量显著上调，而其靶基因PDCD4的表达量明显下调；双荧光素酶报告基因检测证实，ssc-miR-141可直接靶向并结合PDCD4的3’-UTR区，两者之间的表达量存在明显的负调控关系。 综上所述，利用全基因组选择信号揭示藏猪低氧性状相关的候选基因，并通过不同海拔迁居试验，构建 miRNA-mRNA 共表达网络，发现挖掘出的ssc-miR-141在藏猪低氧适应过程中发挥了重要功能，通过对筛选的基因在功能上验证，分析其相互作用及其调控机制，为揭示藏猪低氧适应性提供了理论基础。
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