摘要
先天免疫是机体抵御病原侵害的第一道防线，是脊椎动物，特别是低等脊椎动物抵抗外界病原入侵的重要防御机制。我国是淡水鱼养殖大国，集约化养殖过程中的环境恶化及种质退化极易造成严重的病害问题，其中鲤春病毒(SVCV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)及 Ⅱ 型鲤疱疹病毒(CyHV-Ⅱ)是危害较大的病毒。因此，研究鱼类病毒入侵及宿主细胞免疫应答机制对于抗病鱼种的培育及抗病毒药物的研发具有重要的理论意义。 依据本实验室以往的实验结果， DDX41 和 ZDHHC11 是经 GCRV 感染 CIK细胞的转录组数据筛选出来的两个抗病毒相关蛋白，它们在响应 GCRV 感染后能够上调表达。本文分别研究了草鱼DDX41和斑马鱼ZDHHC11的抗病毒机制。 RNA 解 旋 酶 家 族 (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)-box ATP-dependent RNA helicases, DDX) 已在高等脊椎动物中证明是抗病毒免疫反应的重要蛋白，然而其在鱼类抗病毒反应中功能机制还不清楚。DDX41 是 DDX 家族的重要成员，前期的研究已发现DDX41能响应GCRV感染，因此进一步揭示鱼类DDX41的抗病毒功能能为淡水鱼病毒病防控策略提供新的策略。本研究中，我们克隆并构建了草鱼DDX41基因及其重组质粒，研究了它的抗病毒功能，具体研究结果如下： 通过同源克隆及 RACE-PCR 技术获得草鱼 DDX41 全长 cDNA 序列(MT259185)，该序列编码617个氨基酸，具有保守的DEXDc、HELIc及ZnF结构域。氨基酸序列及系统进化树分析发现，草鱼 DDX41 在鱼类中保守性很高，并与犀牛金线鲃的保守性最高。草鱼DDX41在肠、脾、肾和肝的表达量高，并且GCRV感染草鱼后会诱导DDX41的表达；同样的，在CIK细胞中，GCRV感染促进了DDX41的表达，说明草鱼DDX41参与了抗病毒反应。亚细胞定位分析发现，草鱼DDX41主要定位于细胞核中，随着GCRV刺激时间延长，DDX41逐渐从细胞核穿梭至细胞质中，说明草鱼DDX41主要在细胞质中发挥抗病毒能力；为研究草鱼DDX41在先天免疫反应中的功能，在CIK细胞中过表达DDX41，通过荧光定量PCR及双荧光素酶实验发现，草鱼DDX41能够激活IFN I和ISG15的表达，而 DDX41 与 STING 蛋白共转染要比单转染更能够强烈激活 IFN I 和ISG15 的表达，这就说明草鱼 DDX41 激活先天免疫反应可能是通过 STING 蛋白实现的；另一方面，在 CIK 细胞中敲降 DDX41 后将抑制 IFN I 和 ISG15 的表达。为进一步研究草鱼DDX41与STING之间的关系，本文用GCRV感染细胞，发现草鱼DDX41能与STING发生相互作用。在CIK细胞中过表达DDX41和STING后促进了IRF7的磷酸化及核易位，这就说明，DDX41和STING能够激发了IRF7的活性。以上结果表明草鱼DDX41响应GCRV感染后，从细胞核穿梭至细胞质中，随后与胞质中的 STING 发生互作，然后招募 IRF7，促进 IRF7的激活，最后活化的 IRF7 入核调控 IFN I 和 ISG15 的表达。 棕榈酰转移酶家族是一类能够催化棕榈酰化修饰的蛋白，因其具有保守的天冬氨酸-组氨酸-组氨酸-半胱氨酸(Asp-His-His-Cys, DHHC) 结构域，并且位于一个富含半胱氨酸、锌指样结构域中，因此更多称为“ZDHHC”家族。ZDHHC11是ZDHHC家族的重要成员，然而其作用底物、功能、信号转导机制还不清楚。本研究分析了斑马鱼ZDHHC11的抗病毒功能，具体研究如下： 我们从斑马鱼中克隆了ZDHHC11的全长cDNA序列(XM_009292728)，该序列编码430个氨基酸，包含1个DHHC结构域和4个跨膜结构域。氨基酸序列比对及系统进化树分析发现，鱼类ZDHHC11的氨基酸序列较为保守，其中斑马鱼 ZDHHC11 与其它鱼类相距较远，在进化水平单独形成 1 支。斑马鱼ZDHHC11在各检测组织中均有表达，当收到GCRV和B-DNA刺激后，表达上调，说明ZDHHC11参与了抗病毒反应。在CIK细胞中过表达ZDHHC11后能够激活 IFN I 的表达及 ISRE、NF-κB 启动子的活性，而敲降 ZDHHC11 后则抑制了IFN I 的表达。亚细胞定位实验表明 ZDHHC11、STING 具有相同的定位特征，都定位于内质网上，说明ZDHHC11可能与STING存在功能联系。免疫共沉淀、双分子荧光互补及荧光共定位实验表明 ZDHHC11 能够特异性与 STING发生互作。ZDHHC11与STING通路信号分子共表达实验表明，ZDHHC11能与STING-IRF3 信号轴分子结合并上调 IFN I 的表达，而对 IRF7 没有激活能力，说明ZDHHC11 可能是通过 STING-IRF3 信号轴通路激活 IFN I反应。为进一步探究ZDHHC11和STING对IRF3活性的影响，过表达ZDHHC11和STING后能够促进IRF3从细胞质穿梭至细胞核中，说明ZDHHC11和STING能激活IRF3的转录活性。不同跨膜结构域缺陷ZDHHC11的定位实验发现，包含TM3、TM4的ZDHHC11和WT的ZDHHC11定位现象没有发生改变，而TM0、TM1、TM2的ZDHHC11则丧失了胞质定位现象，同样的，功能性实验也证明包含TM3和TM4 的 ZDHHC11 还能够激活 IFN I 的表达。免疫共沉淀实验发现，只有包含TM3和TM4结构域的ZDHHC11还能够与STING发生互作；另一方面，本文还构建了不同跨膜结构域缺陷STING，定位实验发现，同样包含TM3和WT的STING定位现象没有发生改变，而只包含TM0、TM1和TM2的STING则丧失了胞质定位现象，功能性实验也证明 TM3 和 WT 的 STING 还能激活 IFN I的表达。 总之，本文研究表明鱼类DDX41与ZDHHC11都能通过STING依赖的信号通路激活先天免疫反应，为我们进一步了解病毒侵染鱼类时其核酸分子(DNA或 RNA)与宿主细胞内相关的适配体结合并触发细胞先天免疫系统以及激活相关的信号通路，最终上调 IFN I 和 ISG15 的表达，完成免疫应答提供了新的见解，也为鱼类病毒病的防控提供了新靶点。
NETL