摘要
目的： 三阴性乳腺癌是一种发病机制不明的高度恶性肿瘤，目前缺乏其有效的临床诊疗方案，对于其发病机制、内在作用靶点的探索具有紧迫性和重要性。与三阴性乳腺癌相关的异常激活通路中，PI3K/AKT通路的相关研究已经取得一定进展，基于该通路进一步开展药物干预研究，是解决三阴性乳腺癌内在机制不明问题的切入点之一。瓜蒌贝母饮作为治疗乳腺癌治疗的经典古方，在中医临床实践中有着悠久的历史。基于瓜蒌贝母饮的临床药效，导师孙长岗教授从中提炼出治疗三阴性乳腺癌的核心药对“土贝母-瓜蒌”（以下简称“贝母-瓜蒌”药对）。该药对在导师孙长岗教授对三阴性乳腺癌治疗中展现出良好的临床疗效，但是缺乏现代作用机制的阐发。本研究通过体外细胞实验观察土贝母、瓜蒌及“贝母-瓜蒌”药对对三阴性乳腺癌细胞的抑制作用，探讨两药配伍使用效果较单一中药使用的优越性，探索“贝母-瓜蒌”药对协同顺铂对三阴性乳腺癌细胞增殖、凋亡等恶性表型的影响，阐发“贝母-瓜蒌”药对在中西医结合治疗三阴性乳腺癌中的“增效”作用。此外，深入探讨了药对协同顺铂对PI3K/AKT信号通路及相关凋亡蛋白的抑制作用，以进一步明确“贝母-瓜蒌”药对协同顺铂抑制三阴性乳腺癌的内在机制。 方法： 通过MTT细胞活性实验检测土贝母、瓜蒌、“贝母-瓜蒌”药对对三阴性乳腺癌细胞活性的影响，验证“贝母-瓜蒌”药对的使用与单味中药相比具有更显著的细胞活性抑制作用。进一步开展关于“贝母-瓜蒌”药对及抗肿瘤药物顺铂的基础实验，验证药对在现代抗肿瘤药物中的“增效”作用。通过克隆形成实验验证“贝母-瓜蒌”药对联合顺铂对三阴性乳腺癌细胞增殖能力的影响;划痕实验检测药对联合顺铂后对三阴性乳腺癌细胞迁移能力的抑制作用;通过Transwell侵袭实验验证药对联合顺铂对乳腺癌细胞侵袭能力的抑制作用;利用流式细胞术检验药对联合顺铂对三阴性乳腺癌细胞凋亡情况的影响。最后通过Western blot探究土贝母、瓜蒌、“贝母-瓜蒌”药对及药对联合顺铂对三阴性乳腺癌关键信号通路PI3K/AKT和相关凋亡蛋白Bcl2、Bax的干预作用。 结果： 基于三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231及MDA-MB-468开展体外细胞实验，MTT实验明确了“贝母-瓜蒌”药对及两味单药对三阴性乳腺癌细胞的活性抑制作用，“贝母-瓜蒌”药对较土贝母和瓜蒌单药对细胞活性的抑制作用更强（P＜0.01）。随后的MTT实验证实“贝母-瓜蒌”药对联合顺铂对三阴性乳腺癌细胞活性抑制作用较单用顺铂更显著（P＜0.001）。细胞克隆形成实验表明，“贝母-瓜蒌”联合顺铂后对三阴性乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系增殖抑制效果优于“贝母-瓜蒌”药对及顺铂单药组（P＜0.001）。细胞划痕实验和Transwell细胞侵袭实验结果证实了“贝母-瓜蒌”药对可以有效抑制MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系迁移和侵袭（P＜0.01），并且药对联合顺铂展现了更显著的抗迁移和侵袭效果（P＜0.001）。对于细胞凋亡结局，流式细胞术的实验结果表明“贝母-瓜蒌”药对的应用有效促进两种细胞系的细胞凋亡（P＜0.01），而这一情况在MDA-MB-468细胞系中更加显著，并且“贝母-瓜蒌”与顺铂的联合应用使两种细胞系出现了更加明显的凋亡结局（P＜0.001）。Western blot结果显示土贝母、瓜蒌以及“贝母-瓜蒌”药对的干预显著抑制了 PI3K/AKT通路的表达。正如临床中顺铂所展现出的抗肿瘤效力，顺铂干预三阴性乳腺癌细胞系后PI3K/AKT通路被显著抑制，而顺铂联合中药后可以大大促进这一抑制作用的发生（P＜0.001）。并且，细胞凋亡相关因子Bcl2、Bax的表达也出现异常，其中Bcl2的表达出现升高，Bax的表达降低，这一结局与其本身生物学功能相契合（P＜0.001）。 结论： “贝母-瓜蒌”药对在改善三阴性乳腺癌细胞的恶性表型中具有显著作用，这一作用与土贝母、瓜蒌单药相比具有优越性，这验证了中药药对“贝母-瓜蒌”在三阴性乳腺癌临床治疗中应用的可靠性。“贝母-瓜蒌”药对通过抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭，促凋亡等方式影响肿瘤细胞生长，这一作用可能是通过影响PI3K/AKT通路的表达而产生。此外，多维度的三阴性乳腺癌恶性表型实验证明，“贝母-瓜蒌”药对的协同作用有助于增加顺铂的抗肿瘤药性，甚至与“贝母-瓜蒌”相比展现出更好的抗肿瘤效果，这一结果进一步诠释了未来应用中西医结合的方法治疗三阴性乳腺癌的必要性。
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