摘要
青稞酒是我国西藏地区的一种传统发酵食品，由于缺乏统一的生产标准且规模小，导致存在发酵过程可控性差、风味不稳定，酒的质量参差不齐等问题，使青稞酒的商业化发展面临多重挑战，其中青稞酒的风味品质提升是其研究重点，本课题通过筛选优良的产香非酿酒酵母，以期提升青稞酒中的关键香气物质含量，使酿造出的青稞酒具有香味协调、清雅纯正的独特风格，带动青稞酒产业化的进一步发展。因此，本论文以青稞酒、青稞曲等西藏传统发酵产品为材料，利用传统分离方法进行微生物筛选，构建传统发酵食品微生物资源库，通过发酵特性、产糖苷酶能力分析等选出最佳非酿酒酵母，应用于传统青稞酒酿造中，并通过研究最佳发酵条件，生产出高品质风格突出的传统青稞酒，主要研究结果如下： （1）西藏传统发酵食品微生物菌库构建：从西藏 4 个不同地区中采集的青稞酒、青稞酒曲、传统奶制品进行微生物筛选，经过细胞形态观察菌落形态，初步筛选出200株酵母菌、39 株细菌、31 株霉菌。将所分离的 270 株菌进行 ITS、27F DNA 基因序列分析，确定其种属为酵母属（Saccharomyces）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、毕赤酵母属（Pichia）、复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、红酵母属（Rhodotorula）、假丝酵母属（Candida）、Vishniacozyma、掷孢酵母属（Sporidiobolus）、Naganishia属、Kazachstania、棒孢酵母属（Clavispora）、Torulaspora属、Zygosaccharomyces、毛霉属（Mucor）、青霉属（Paecilomyces）、根霉属（Rhizopus）、曲霉属（Aspergilus）、Coriolopsis、Irpex、栓菌属（Trametes）、地霉属（Geotrichum）；芽孢杆菌属（Bacillus）、乳杆菌属（Lactobcillus）、干燥杆菌属（Siccibacter）、Pseudescherichia vulneris、片球菌属（Pediococcus）、乳球菌属（Streptococcus）共计27种属。 （2）基于宏基因组学的西藏青稞酒中微生物多样性与风味形成关系的研究。利用宏基因组测序技术与固相微萃取气质联用色谱法分析青稞酒发酵过程中微生物多样性、风味物质变化特征及优势微生物属及其对关键代谢通路的贡献度。结果显示，在青稞酒样品中，乳酸杆菌属、根霉属、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属为发酵过程中主要优势菌，与青稞酒风味形成的贡献度更相关；宏基因组测序总共获得去冗长基因823,072个，物种注释得到 5 个门微生物进行 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)基因功能注释，全局和概述图谱(Global and overview maps)、碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism)、信号传导(Signal transduction)、能量代谢(Energy metabolism)和氨基酸代谢(Amino acid metabolism)的相对丰度处于高水平。本研究有助于阐明青稞酒发酵过程中不同种类微生物在风味形成中的代谢作用。 （3）西藏传统发酵食品优良非酿酒酵母菌的筛选：从200株酵母菌中筛选出29株具有代表性的酵母菌，对这些酵母菌采用杜氏管发酵法进行酵母菌生理生化试验，检测不同种属酵母菌对糖利用能力、碳源氮源同化能力和尿素分解能力，也为全面评价西藏传统发酵食品中优良菌株性能奠定坚实基础。通过对分离纯化非酿酒酵母菌进行产气性能测定，选择在24h内完成产气量的酵母菌进行耐受性试验，通过耐酒精、pH、葡萄糖试验保留23株酵母菌进行β-葡萄糖苷酶活性检测，筛选出酶活力值最高为ZJ46、ZJ47，分别为 0.059、0.062U/mL，比对照菌高约 0.021U/mL，并对 ZJ46、ZJ47 进行安全性评价，发现ZJ46与ZJ47酵母菌均无溶血现象，ZJ46与ZJ47对4种抗真菌药物产生敏感且部分耐药；将ZJ46与ZJ47酵母菌基因组序列与CARD、VFDB数据库比对，ZJ46菌株共检测出20种耐药基因，27种毒力基因，ZJ47共检测出28种耐药基因，44种毒力基因，按照其标准查找，均低于标准值。综合分析，ZJ46与ZJ47酵母菌相对安全。 （4）非酿酒酵母ZJ46、ZJ47混菌发酵青稞酒工艺优化：本试验为确定青稞酒发酵最佳工艺条件，将ZJ46与ZJ47通过单因素试验以及响应面优化试验得到最佳工艺条件分别是接种量2.5%，发酵温度30℃，初始糖度13°Brix，酒精度2.85%vol；接种量2%，发酵温度 30℃，初始糖度 13°Brix，酒精度 3.31%vol。以得到最佳工艺条件按照相同接种比例分别与黄酒酵母进行混合发酵，采用同时接种与顺序接种，检测青稞酒的理化指标与挥发性风味物质组成。结果表明，发酵完的青稞酒总糖、总酸、酒精度均符合国家标准。青稞酒中影响较大的挥发性风味物质有42种，包括22种酯类物质，12种醇类物质，包括醛酮酸等。通过对香气物质的分析，发现顺序接种试验中间隔48h再接黄酒酵母能够显著提高青稞酒中香气成分物质种类与含量，增加青稞酒的果香味与风味复杂度。
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