摘要
目的： 近年来，随着糖尿病（Diabetes mellitus，DM）的发展和流行，糖尿病并发症受到广泛关注。糖尿病认知功能障碍（Diabetic cognitive dysfunction，DCD）是常见的糖尿病并发症之一，患者学习能力记忆能力下降，具有发病隐匿、诊断困难、预后差等特点，目前尚无有效预防措施。如何采取膳食干预延缓DCD发生已成为近年来营养学领域研究的热点问题。研究表明，主动DNA去甲基化在神经可塑性与记忆功能中起着关键作用。已有研究发现，增加膳食纤维摄入量可有效改善血糖及认知功能，但膳食纤维与DCD发生风险的关联国内外尚鲜见报道。岩藻多糖是一种具有抗氧化、抗炎、抗凋亡及修饰表观遗传潜力的水溶性膳食纤维，对DCD的保护机制尚不清楚。因此，本论文首先采用横断面研究，分析 DM 患者膳食纤维摄入情况与其认知功能的关系；其次，进行动物实验，通过高脂饮食喂养构建DCD模型，使用不同浓度岩藻多糖干预，揭示岩藻多糖预防DCD的效果及DNA表观遗传机制，以期为制定预防DCD营养改善措施提供依据。 方法： 本研究第一章采用横断面研究方法，纳入2023年12月至2024年3月在青岛某市级医院被确诊为 DM 的患者，收集患者病历资料及临床检测化验结果。通过问卷收集一般人口学特征，采用简易智能精神状态检查量表（Mini-Mental State Examination， MMSE）和蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）评估认知功能，依照MoCA 评分结果将患者分为糖尿病认知功能障碍（DCD）组（MoCA ＜ 26分）和糖尿病认知功能正常（Non-DCD）组（MoCA ≥ 26 分）。采用膳食频率回顾法调查膳食摄入情况。采用双变量相关性分析和多因素logistic回归分析方法探索膳食纤维摄入情况与DCD的关联。 本研究第二章动物实验选用雄性C57BL/6J小鼠，适应性喂养一周后随机分组。分为对照组（CON）、模型组（MOD）、50mg/kg岩藻多糖干预组（FC50）、100mg/kg岩藻多糖干预组（FC100）、200mg/kg岩藻多糖干预组（FC200）及二甲双胍阳性对照组（MTF）。CON组用 10% kcal 饲料（D12450）喂养，其余组用 60% kcal 高脂饲料（D12492）喂养。CON组和MOD组使用0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃，FC50组、FC100组和FC200组分别使用50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg岩藻多糖溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃，MTF组使用150mg/kg二甲双胍溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃，连续喂养24周。喂养期间进行口服葡萄糖耐量试验（Oral glucose tolerance test， OGTT）和胰岛素耐量试验（Insulin tolerance test，ITT）实验。第 20-21 周时进行小鼠行为学测试，包括Morris水迷宫实验、新物体识别实验、旷场实验。第24周时处死小鼠，收集血清，脑组织等生物样品置于-80℃储存。使用生化分析仪检测血清生化指标， HE 染色和 TUNEL 染色观察脑组织病理及神经元细胞凋亡情况，Dot blot 实验检测脑组织DNA 表观遗传修饰相关产物表达水平，Western blot 实验检测脑组织 DNA 表观遗传修饰相关催化酶及三羧酸循环相关蛋白酶表达水平，采用高效液相色谱串联质谱法检测三羧酸循环中间代谢产物，使用ELISA方法检测甲基供体。 结果： 1、人群横断面研究结果 研究共纳入50岁以上糖尿病患者180人，根据MoCA判别标准，研究对象中DCD患者121 例，患病率为 67.2%。DCD 组平均年龄（67.55 ± 9.38）显著高于 Non-DCD 组平均年龄（63.34 ± 7.20）（P ＜ 0.05）。从性别来看，DCD 组中女性占比（52.1%）显著高于男性（47.9%）（P ＜ 0.05）。DCD 组冠心病病史（52.1%）显著高于 Non-DCD 组（34.7%）（P ＜ 0.05）。两组的空腹血糖（Fasting blood glucose，FBG）尽管没有统计学意义，但DCD 组 FBG（7.17 mmol/L）数值上高于 Non-DCD 组（6.81 mmol/L）。膳食营养摄入分析结果显示，DCD 组能量摄入（1377.00 kcal）、碳水化合物（148.95 g）、总膳食纤维（9.61 g）、维生素 B1（0.68 mg）水平显著低于 Non-DCD 能量摄入（1542.20 kcal）、碳水化合物（173.52 g）、总膳食纤维（12.01 g）、维生素 B1（0.76 mg）（P ＜ 0.05）。相关性分析发现总膳食纤维摄入量与注意力、抽象思维及定向力评分存在显著正相关关系（P ＜ 0.05）。多因素 logistic 回归分析调整年龄、性别、教育程度、BMI、高血压病史、血脂异常病史、冠心病病史、能量摄入、户外活动时间为混杂因素，结果显示DM 患者中较高总膳食纤维摄入量与患 DCD 呈负相关（P ＜ 0.05）。 2、动物实验研究结果 （1）Morris水迷宫实验中，与CON组相比，MOD组小鼠的逃避潜伏期显著升高，而穿越平台次数、平台区域游泳距离和平台区域时间百分比均显著降低（P ＜ 0.05）。与MOD组相比，MTF组、FC50组、FC100组和FC200组的逃避潜伏期明显缩短，穿越平台次数和平台区域时间百分比明显增加，平台区域游泳距离百分比在FC100和FC200组中增加（P ＜ 0.05）。新物体识别实验中，与 MOD组比，其余各组的认知指数和偏好指数均显著提高（P ＜ 0.05）。旷场实验中，所有组之间在角落和中心区域活动距离百分比和外围活动时间百分比无明显差别。 （2）MOD组小鼠的体重变化显著高于其余各组，MOD组脑部脏器指数显著低于其余各组。OGTT实验中，第8周和第24周MOD组曲线下面积显著高于CON组，第8周FC50和FC200组曲线下面积显著低于MOD组，第24周MTF组，FC100和FC200 组曲线下面积显著低于 MOD组（P ＜ 0.05）。MOD组小鼠的空腹血糖、空腹胰岛素和HOMA-IR指数显著高于CON组，与MOD组相比，MTF组、FC100组和FC200组小鼠的空腹胰岛素和 HOMA-IR 指数均显著降低（P ＜ 0.05）。MOD 组血清 TC、HDL-C和LDL-C水平显著高于CON组，MTF组、FC50组、FC100组和FC200组TC和LDL-C均显著低于MOD组，MTF组、FC50组和FC100组HDL-C显著低于MOD组（P ＜ 0.05）。MOD组和 CON组的 TG 水平无统计学差异，MTF组、FC50 和 FC200组TG 水平显著低于MOD 组（P ＜ 0.05）。 （3）MOD 组神经元细胞凋亡率、促凋亡蛋白 Bax 与抑制凋亡蛋白 Bcl2 之比、Cleaved Caspase-3/Caspase-3 及细胞色素 C 的蛋白表达水平较 CON 组显著升高，而神经元存活相关蛋白NeuN 的蛋白表达水平较 CON组显著降低（P ＜ 0.05）。与 MOD组相比，MTF组、FC50组、FC100组和FC200组的神经元细胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax与抑制凋亡蛋白 Bcl2 之比、Cleaved Caspase-3/Caspase-3 及细胞色素 C 的蛋白表达水平明显降低，NeuN 的蛋白表达水平显著增高（P ＜ 0.05）。 （4）DNA 5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）水平在各组间无显著差异。与MOD组相比，其余各组小鼠大脑基因组 DNA 5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine， 5hmC）和 DNA 5-甲酰胞嘧啶（5?formylcytosine，5fC）总体水平显著增加（P ＜ 0.05）。结合行为学指标进行相关性分析，结果显示脑内 5hmC和 5fC水平与目标潜伏期呈负相关，与穿越平台次数、平台区域游泳距离和平台区域时间百分比、认知指数、偏好指数呈显著正相关（P ＜ 0.05），而上述结果在 5mC 中未观察到。 结论： （1）DM患者的总膳食纤维摄入量与其注意力、抽象思维及定向力评分存在正相关关系，适量的膳食纤维摄入可能是DCD的保护因素。糖尿病患者较高膳食纤维摄入与患DCD存在负相关。 （2）岩藻多糖通过改善三羧酸循环稳态提高TET酶活性，通过激活p-AMPK提高 TET 2 蛋白稳定性，进而促进 TET 2 介导的主动 DNA 去甲基化，促使 DNA 表观遗传维持动态平衡，最终预防糖尿病认知功能障碍的发生。
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