摘要
背景：RNA选择性剪接（Alternative splicing，AS）又称可变剪接，是一种通过选择不同剪接位点组合来产生多个mRNA剪接异构体，从而表达不同蛋白质的过程。人类AS的失调与各种复杂疾病的发生发展密切相关。病毒感染是多种疾病的诱因，它们通过操纵宿主的AS来进行自我复制以及逃避宿主的抗病毒反应。然而，当前关于严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 （ SARS-CoV-2 ）引发的新型冠状病毒感染（Corona virus disease 2019，COVID-19）对宿主AS的改变还不甚了解。另外，乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）的主要诱因之一。值得注意的是，乙肝病毒相关性肝细胞癌（HBV-HCC）患者肿瘤组织较正常样本肝脏组织存在高度的剪接差异，这些变化在HCC的发生过程中的作用尚不明确。因此，系统分析病毒感染对宿主AS事件的影响，有望为筛选和监测COVID-19和肝细胞癌发生发展提供潜在的生物标志物。 目的：对新型冠状病毒感染患者和HBV-HCC患者体内的选择性剪接和转录本异构体的改变进行系统分析，探讨AS变化与宿主临床特征的关联，从而为病毒感染性疾病的筛选和治疗提供生物靶标。 方法：应用转录组测序和液相色谱串联质谱技术，对差异表达的蛋白、基因和失调的转录本进行GO和KEGG功能富集分析。使用CIBERSORTx软件计算肿瘤浸润的免疫细胞占比。采用rMATS软件分析差异AS事件，并通过半定量RT-PCR实验验证差异转录本异构体变化。SwissDock模拟不同亚型的药物靶基因与小分子化合物的结合情况。利用 STRING 数据库构建差异表达基因的蛋白质互作网络，探究HBV-HCC中的关键基因，运用UALCAN数据库和HPA数据库验证关键基因的mRNA和蛋白质水平表达差异。最后，通过免疫荧光染色，分析选择性剪接与免疫浸润的关联。 结果：SARS-CoV-2感染导致了广泛的转录本失调，我们在9例COVID-19样本和10例对照样本之间观察到1,383个DTUs（Differential transcript usage）和3,937个DTEs（Differential transcript expression）。GO功能富集分析发现，这些DTU和DTE基因显著富集到凝血、中性粒细胞活化和细胞因子的产生等通路。值得注意的是，在COVID-19患者中，CD74和LRRFIP1发生了显著的外显子跳跃事件，这将导致蛋白质结构域缩短，可能与抗病毒免疫降低相关。通过半定量RT-PCR对6个基因（包括CD74和LRRFIP1）的外显子跳跃事件进行验证，结果基本与转录组测序结果一致。此外，我们发现转录本的失调还与COVID-19的临床严重程度密切相关，AS异常可能导致相反的治疗效果。总之，更好地了解AS全貌可能有助于COVID-19的诊断和治疗。 5例正常样本与5例HBV-HCC样本鉴定出3,247个差异表达基因。运用STRING数据库分别构建差异表达上调和下调基因集的PPI网络，找到了11个上调和12个下调关键基因，发现这些关键基因的异常表达与患者的生存时间密切相关，并基于UALCAN数据库和HPA数据库中的肝癌样本大数据，验证了在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。通过CMap分析我们确定了几种可能逆转关键基因表达的小分子化合物。此外，在病例组和对照组中共鉴定出3,731个DTEs，其中34个DTEs的基因显著富集到剪接体通路。在肝细胞癌及对照样本之间发现6,741个基因剪接发生变化，检测到9,765个差异剪接事件，其中外显子跳跃事件占比38%。重要的是，我们发现7个剪接体基因（SNRPA1、LSM2、PUF60、RBM25、HNRNPC、SF3B3和TXNL4A）同时发生了DTE和外显子跳跃事件，表明肝细胞癌患者中细胞剪接功能异常。此外，我们还发现剪接失调程度与肝细胞癌中的免疫浸润、PD-1和PD-L1的表达成正相关。结论：本研究发现SARS-CoV-2感染通过对宿主剪接体的影响，使宿主AS功能失调，进而引起广泛的转录本表达异常。此外，本研究确定了与HBV-HCC相关的关键基因、显著失调的代谢及信号通路和潜在的靶向药物，发现了HCC患者肝脏肿瘤组织中包括剪接体基因在内的大量基因发生了差异AS事件，明确了剪接失调的水平与肝细胞癌的免疫浸润的关联。总之，我们的研究为病毒感染性疾病中选择性剪接异常研究提供了理论基础。
NETL