摘要
目的: 尼古丁是香烟中主要的致瘾性成分，尤其是在生命早期接触尼古丁后对神经发育的潜在危害更加值得关注。尼古丁通过血液进入胎盘，并直接影响胚胎和婴幼儿的大脑发育过程。在这个阶段，由于神经系统处于高度敏感期，接触到尼古丁可能导致突触形成异常、神经递质功能紊乱及行为学异常等问题。然而，母鼠尼古丁暴露导致子代神经发育毒性的确切机制尚不清楚。本研究探讨母鼠尼古丁暴露对子代海马突触形成的毒性作用及LncRNA/miRNA/mRNA介导的表观遗传学机制;探究母鼠尼古丁暴露对子代青春期小鼠社交行为和空间记忆力缺陷的影响，为阐明母鼠尼古丁暴露对子代神经发育毒性及其机制提供科学依据。 方法: (1)建立母鼠尼古丁饮水模型:将32只成年C57BL/6小鼠(雌雄比例为3∶1)，随机分为对照组(Veh)和尼古丁组(Nic)。在雌雄交配前2周，尼古丁组雌性小鼠饮用200μg/ml尼古丁饮用水以1％(w/v)糖精钠溶液为溶剂。对照组雌性小鼠给予1％糖精钠。子代出生20天后停止饮用尼古丁和糖精钠溶液。 (2)三箱实验(Three-chamber Test)和Y迷宫实验(Y-maze Text):在子代出生第40天进行。 (3)基因芯片检测、验证及分析:对照组和尼古丁组随机各取3只出生20天的子代小鼠海马进行LncRNA芯片V3.0芯片分析。通过设置p≤0.05和Fold change≥1.5的差异表达阈值，筛选出差异基因，做qPCR验证;并对差异基因进行GO和KEGG,GSEA,ceRNA网络调控预测分析。 (4)高尔基-考克斯染色:出生第20天子代小鼠经4％PFA心脏灌流之后取脑，用固定液避光保存两周，之后用30％蔗糖沉淀组织，之后振荡切片200μm进行高尔基染色用于观察海马树突棘数量的变化。 (5)组织学与分子生物学检测:出生20天后子代心脏用4％PFA灌流后取脑;使用冰冻切片机进行海马冠状切片，片厚40μm;免疫荧光染色检测PSD95在小鼠海马中表达水平。制备20天小鼠海马的蛋白裂解液，蛋白质免疫印迹定量分析NMDAR2A-PSD95-nNOS三元复合物以及p-nNos,p-p38,mef2c的表达水平。 结果: (1)母鼠尼古丁饮水模型构建成功:尼古丁饮水母鼠的尿液可替宁浓度最大可达1000ng/ml以上，对照组母鼠尿液可替宁含量极低。 (2)行为学实验结果:在检测社交能力的三箱实验中，发现对照组子代小鼠停留在陌生鼠1箱室比空的箱室的时间长，而尼古丁组子代小鼠停留在陌生鼠1箱室和空箱室的时间没有表现出明显的趋势。在社会新颖性偏好测试中，结果显示，与对照组相比，尼古丁组在陌生鼠2箱室时间明显降低。表明尼古丁小鼠没有表现出对新颖事物的探索。在Y迷宫的自发交替测试中，与对照组相比，尼古丁暴露组小鼠的自发交替数量降低。在新臂实验中，与对照组相比，尼古丁组小鼠在熟悉臂的时间比在新臂时间长，表明尼古丁组降低了新臂的识别。 (3)尼古丁暴露改变子代海马LncRNA和mRNA基因表达:尼古丁组显著上调的LncRNA有242个，下调的LncRNA有156个，上调的mRNA中有132个，下调的mRNA有163个。根据GO和KEGG分析，筛选出调控神经发育的基因，并做qPCR验证数据准确性。此外，根据LncBase Predicted v.2数据库找到目标LncRNAs相对应的靶miRNA,利用miRDB,miRWalk数据库预测调控miRNA的靶mRNA，最后我们筛选出GM13530-miR-7119-3p-mef2c ceRNA网络，并根据生物信息学分析得到ceRNA调控的生物学功能。 (4)海马高尔基-考克斯浸渍法染色结果，发现尼古丁组小鼠海马DG，CA1和CA3区树突棘密度高于对照组。 (5)免疫荧光染色结果显示，尼古丁子代小鼠海马神经兴奋性毒性指标(NMDAR2A、PSD95和nNOS)蛋白水平表达增加，NMDAR2B的表达量无统计学差异;兴奋性毒性相关的p38MAPK通路激活。尼古丁受体a7nAChR蛋白水平表达降低。 结论: 母鼠尼古丁暴露诱发海马神经兴奋性毒性，导致子代海马体依赖的空间记忆功能和社交障碍。一种新的LncRNNA(GM13530)在尼古丁暴露的子代小鼠海马中表达下调，可能通过ceRNA机制调控mef2c降低，导致树突棘数量异常增加。
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