摘要
猪圆环病毒 2 型（porcine circovirus type 2，PCV2）是猪圆环病毒病（porcine circovirus disease，PCVD）和猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus associated disease， PCVAD）的主要病原体。PCV2 感染可下调宿主免疫系统，增强其它病原体的感染和复制。自 20世纪 90年代后期发现 PCV2以来，每年给世界养猪业造成巨大的经济损失。目前，针对 PCV2a和 PCV2b基因型疫苗对 PCV2d基因型的疫苗效力引起相当大关注，亟须掌握PCV2的流行情况以便做出应对。 本研究对采集的临床样本进行 PCR检测，分析 PCV2在豫北地区的流行情况；用PK-15细胞分离培养出一株PCV2毒株；通过原核表达成功获得重组Cap蛋白，免疫小鼠后获得多克隆抗体，初步建立了检测 PCV2抗体的间接 ELISA检测方法。主要研究内容如下： 1.对2020~2023年从豫北地区采集的疑似PCV2的2125份病料进行PCR检测，统计分析PCV2在豫北地区的流行情况。结果 PCV2阳性率为39.44%（838/2125）。其中2020年PCV2阳性率为58.66%（227/387）；2021年阳性率为33.27%（175/526）；2022年阳性率为20.81%（159/764）；2023年阳性率为61.83%（277/448）。流产胎PCV2阳性率为 31.58%（30/95）；仔猪阳性率为 35.27%（237/672）；保育猪阳性率为 52.89%（339/641）；育肥猪阳性率为 31.99%（87/272）；母猪阳性率为 32.58%（145/445）。血液样品 PCV2阳性率为 41.38%（355/858）；组织样品阳性率为 46.60%（445/955）；肠内容物样品阳性率为12.18%（38/312）。PCV2与CSFV混合感染率为15%（12/80）。基于ORF2筛选获得3株基因序列，1株与中国黑龙江毒株PCV2/HLJ/HLJ4/2019的亲缘关系最近，属于 PCV2a 亚型；两株分别与中国甘肃兰州毒株 HN1407和中国河南毒株DF-1的亲缘关系最近，属于PCV2d亚型。以上结果可为豫北地区PCV2的流行监测及调控提供参考。 2.用PK-15细胞分离培养出一株PCV2毒株。将组织液接种到单层生长的PK-15细胞，结果随着盲传代数的增加，病毒毒力逐渐减弱。对所分离病毒进行间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay，IFA）鉴定，结果与对照组相比，感染病毒的 PK-15细胞会产生特异性荧光，而对照组未见特异性荧光。根据 Reed-Muench方法计算出分离毒株的病毒滴度为 10-4.8/0.1 mL。在透射电子显微镜下可以看到分离的病毒粒子为球形、无囊膜、直径约 17~20 nm，符合圆环病毒的特征，为研究 PCV2 的分子生物学与致病机理等相关领域提供理论依据。 3.基于 PCV2d Cap 基因通过原核表达获得重组 Cap 蛋白。根据本研究测序获得的PCV2d 毒株的 Cap 基因保守序列设计特异性引物，上下游分别加入 BamH I 和 Xho Ⅰ酶切位点，将 Cap 基因克隆到 pET-32a(+)载体上，构建重组质粒 pET-32a-Cap，转化至BL21（DE3）感受态细胞中进行诱导表达。通过 SDS-PAGE电泳，重组 Cap蛋白主要在沉淀中表达，大小约为 46 kDa，在 0.6 mM IPTG、30℃条件下诱导 12 h大量表达重组蛋白。Western blot 印迹表明，纯化的重组蛋白活性良好，BCA 蛋白浓度测定试剂盒测得重组蛋白浓度为0.91032 mg/mL。将纯化后的重组Cap蛋白免疫3只BALB/c小鼠，以PCV2病毒包被酶标板，用间接ELISA测得3只小鼠血清效价均达到1∶6.4×103，其中2号小鼠血清效价最高为1∶1.28×104，为建立PCV2免疫学检测方法奠定基础。 综上所述，本研究对豫北地区PCV2的流行病学调查研究，表达纯化出重组Cap蛋白，初步建立间接 ELISA检测方法，为豫北地区 PCV2流行监测及诊断方法提供数据支撑。
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