摘要
肿瘤免疫疗法是通过激活机体自身免疫功能消除肿瘤的治疗方法，在肿瘤治疗领域受到广泛关注。然而，免疫抑制肿瘤微环境的存在导致其治疗效果不佳，成为限制肿瘤免疫治疗临床应用的主要障碍。因此，需要逆转免疫抑制的肿瘤微环境，提高肿瘤免疫治疗效果。外泌体作为细胞分泌的内源性纳米囊泡，具有低免疫原性、跨越生物屏障和易于修饰等特性，在肿瘤治疗和药物递送领域发挥重要作用。鹿茸干细胞来源的外泌体具有一定的抗肿瘤潜力。基于此，本研究构建了靶向肿瘤相关巨噬细胞的工程化鹿茸干细胞外泌体用于肿瘤免疫治疗，为基于干细胞外泌体的肿瘤治疗提供了新思路。研究内容及结果如下: (1)本研究从梅花鹿鹿茸的间充质层提取鹿茸干细胞(ASCs)，流式细胞术和免疫荧光实验结果表明ASCs表达间充质干细胞标志蛋白CD44和CD90;可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。收集ASCs培养上清液，比较了超速离心法、膜亲和法和尺寸排阻色谱法提取的鹿茸干细胞外泌体(ASCs-Exo)的物理学特性，并最终确定超速离心法提取的ASCs-Exo具有最高的外泌体纯度;透射电镜显示ASCs-Exo呈茶托状结构;纳米库尔粒度仪测定ASCs-Exo的粒径为66 nm,zeta电位为-22±4.2 mV;Western blot检测ASCs-Exo表达外泌体标志蛋白CD81、Alix和TSG101;ASCs-Exo能够在人工肠液和人工胃液中保持稳定，具有良好的生物稳定性;此外，蛋白质组学和脂质组学测序结果显示ASCs-Exo富含多种蛋白质和脂质成分。 (2)在ASCs-Exo表面修饰M2巨噬细胞靶向肽(M2Pep),并封装TLR3激动剂poly(I∶C),得到工程化鹿茸干细胞外泌体M2Pep-Exo(pIC)。相比于ASCs-Exo和M2Pep-Exo,M2Pep-Exo(pIC)粒径增加至85 nm,zeta电位变为-13±2.8 mV,呈茶托状结构，说明靶向肽修饰和poly(I∶C)封装成功，并依然保持外泌体完整性;荧光显微镜观察该工程化外泌体在不同细胞中的内化水平，结果显示其在M2型肿瘤相关巨噬细胞(M2-TAMs)中的吸收显著增加;通过流式细胞术定量测定其摄取效率，同样表明在M2-TAMs中的摄取率最高。 (3)采用transwell共培养系统构建肿瘤相关巨噬细胞模型，通过免疫荧光染色、qRT-PCR实验和ELISA检测M2Pep-Exo(pIC)处理后肿瘤相关巨噬细胞表型变化。结果显示，M2Pep-Exo(pIC)处理后M1标志物iNOS、TNF-α、IL-6和IFN-γ表达上调或分泌增加，M2标志物CD206、IL-4和IL-10表达下调或分泌减少，证实M2Pep-Exo(pIC)能够显著促进M2-TAMs向M1表型极化。经M2Pep-Exo(pIC)极化的M1型巨噬细胞能够显著抑制肿瘤细胞生长，表明M2Pep-Exo(pIC)能够在体外逆转肿瘤相关巨噬细胞表型，激活免疫细胞的抗肿瘤免疫反应。此外,流式细胞术结果显示M2Pep-Exo(pIC)处理后树突细胞成熟标志物CD80和CD86表达增加,ELISA检测树突细胞促炎细胞因子TNF-α和IL-6释放增加，表明M2Pep-Exo(pIC)能够促进树突细胞熟化，进一步激活免疫反应。 (4)建立4T1小鼠肿瘤模型，验证M2Pep-Exo(pIC)的体内抗肿瘤效果。首先，通过冷冻切片检测荧光标记后ASCs-Exo和M2Pep修饰的ASCs-Exo(M2Pep-Exo)在体内的生物分布。结果显示ASCs-Exo和M2Pep-Exo的主要靶器官均为肝脏和肾脏，但M2Pep-Exo在肿瘤部位的累积显著高于ASCs-Exo,说明M2Pep修饰能够实现在小鼠体内的肿瘤靶向性。经不同制剂治疗后,小鼠肿瘤生长均受到不同程度的抑制，其中M2Pep-Exo(pIC)的抑制效果最显著。肿瘤组织TUNEL染色和Ki67免疫荧光染色结果表明M2Pep-Exo(pIC)治疗显著促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖;流式细胞术、免疫荧光和qRT-PCR实验证实小鼠肿瘤组织中M2-TAMs被极化为M1表型,树突细胞成熟程度增加，肿瘤组织T细胞浸润增加，说明M2Pep-Exo(pIC)治疗逆转了肿瘤微环境的免疫抑制状态，增强了机体的抗肿瘤免疫反应。小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑和肌肉的HE染色结果和小鼠体重变化显示M2Pep-Exo(pIC)具有良好的生物安全性。 (5)建立“双边”小鼠肿瘤模型来模拟转移瘤，评估M2Pep-Exo(pIC)与PD-L1抗体联用对抗肿瘤转移的效果.结果显示M2Pep-Exo(pIC)与PD-L1抗体联用进一步极化M2-TAMs,增加巨噬细胞的抗肿瘤能力，显著抑制原发性肿瘤生长，有效降低肿瘤转移的发生。
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