摘要
背景：牙齿是人体的重要器官，具有咀嚼食物、辅助发音和维持美观等功能。乳牙替换后，恒牙一旦缺失无法再生。保存新鲜拔除的健康人类牙齿可以为自体牙齿移植提供供体牙和为细胞治疗提供自体牙源性干细胞。因为体外储存的自体牙齿使用日期不确定，从年轻时拔牙到中年需要自体牙或细胞移植，往往需要很长的时间，在此期间保存牙周膜细胞的活力和潜能是关键点，直接决定了其今后的应用价值。本研究旨在评价抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine， NAC）结合玻璃化冷冻技术在体外保存人牙周膜组织的效果，并初步探讨NAC在牙周膜组织冷冻保存中的作用机制。 方法：从新鲜拔除的健康人恒牙中分离培养人牙周膜细胞（PDLCs），制备人牙周膜细胞膜片，收集临床上因正畸拔除的单根前磨牙，收集实验大鼠的健康磨牙。冻存样本包括牙周膜细胞膜片，新鲜拔除的人前磨牙和大鼠磨牙，采用程序化慢速冻存或玻璃化冻存法，选择含有或不含有NAC的冻存液对样本进行体外保存，冻存三个月后复苏。使用活/死细胞染色试剂盒检测牙周膜细胞膜片细胞存活率，采用ROS荧光探针法检测冷冻保存后牙周膜组织中ROS水平。采用 mRNA 测序分析冷冻保存对牙周膜细胞膜片基因表达的影响。采用western blot评估catalase、SOD-2、caspase-3和LC3A/B的表达。使用透射电子显微镜观察冷冻保存后牙周膜细胞内微观结构。Hamp;E染色后显微镜下观察冷冻保存后牙周膜细胞膜片、人和大鼠牙齿的组织学形态改变。免疫组织化学法检测人牙周膜中目标蛋白的表达和分布。从冷冻保存的人牙周膜组织中分离培养 PDLCs，鉴定所分离细胞表面抗原，评估增殖和多向分化能力。在冷冻保存液中加入PI3K-AKT激活剂（SC79）或抑制剂（LY294002），进一步研究调节PI3K-AKT 通路对冻存后人牙周膜细胞活力的作用。使用 Graphpad Prism 9.5.1 软件通过单因素方差分析进行统计分析，然后进行Tukey检验作为事后比较。所有数据均以平均值±标准差（Mean±SD）表示， P＜0.05时被认为具有统计学意义。 结果：玻璃化冷冻保存基本保存了人和大鼠牙原有的组织学形态，冻存前后的牙周膜形态改变较小，但冻存后的组织中存在少许撕裂和空泡。冻存前后的细胞膜片中均存在部分死细胞，相比传统程序化慢速冷冻，玻璃化冻存更好地保存了细胞的活性。从冻存后的牙周膜组织中可以分离培养出牙周膜细胞，细胞表面抗原表型无改变，仍具有增殖能力，多向诱导分化实验证明了所分离细胞具有成骨、成脂及成软骨分化的能力。在冷冻保存液中加入NAC对牙周膜组织有较好的保存效果，降低了ROS水平。在冷冻保存液中添加NAC提高了人牙周膜细胞冻存后的存活率，有助于更好地保存细胞的成骨分化能力，上调了SOD-2和catalase的表达，并抑制细胞凋亡。mRNA测序结果显示一共检测到 866 个差异表达基因。与未冷冻保存组相比，不含NAC的玻璃化冻存组有370个基因上调，334个基因下调。添加NAC的玻璃化冻存组中有 323 个基因上调，311个基因下调。KEGG 富集通路分析显示 PI3K-AKT 通路显著激活，在玻璃化冻存液中加入PI3K-AKT激活剂SC79可以提高冻存后牙周膜细胞的存活率。 结论：玻璃化冻存技术可以作为新鲜拔除的牙齿体外保存的方法。在冷冻液中添加NAC有助于保存冷冻后牙周膜组织的存活和功能。调节PI3K-AKT通路是提高牙周膜组织冻存效果的一种潜在方法。
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