摘要
弓形虫病(Toxoplasmosis)是一种重要的人兽共患病，对孕妇和免疫缺陷的人或动物的危害尤为严重。目前，国际上仅有一款基因缺失疫苗用于预防羊的流产。我国没有有效的疫苗用于预防此病。目前抗弓形虫药物只对弓形虫速殖子有效，尚不能清除缓殖子。亟需抗弓形虫新型药物或疫苗。 弓形虫顶质体为二次内共生细胞器，拥有四层膜结构。多个顶质体转运蛋自已经被证明对虫体存活、顶质体自身的维持或虫体代谢至关重要。弓形虫顶质体是否存在其它关键的跨膜转运蛋白尚不明确。转运蛋白可以参与多种物质的跨膜转运，在细胞生长、稳态和信号传导中具有重要作用。其中，主要促进子超家族(Major facilitator superfamily，MFS)与P型-ATPase家族蛋白在多种疾病中可作为良好的药物靶点。然而，顶质体MFS家族蛋白、P型-ATPase家族蛋白以及Bestrophin家族蛋白作为药物靶点的可行性尚不清楚。因此，弓形虫顶质体MFS家族蛋白、P型-ATPase家族蛋白以及Bestrophin家族蛋白的鉴定及其功能性分析将为弓形虫新型药物靶点的发现提供理论指导。 本研究鉴定了 3个顶质体新型转运蛋白。由于其为多跨膜蛋白，将其命名为TgAMMP1(Toxoplasma gondii Apicoplast Multiply Membrane-spanning Protein 1)、TgAMMP2 及 TgAMMP3。通过生物信息学分析发现TgAMMP1属于MFS家族蛋白，TgAMMP2属于P型-ATPase家族蛋白，而TgAMMP3与Bestrophin家族蛋白有同源性。为探讨其对虫体生长的影响，本研究利用Cre-IoxP系统构建了 TgAMMP1、TgAMMP2和TgAMMP3的条件性敲除虫株。虫体增殖实验结果表明TgAMMP1和TgAMMP2的缺失会严重影响虫体生长，TgAMMP3的缺失并未影响虫体生长。本研究进一步利用激光共聚焦显微镜观察发现TgAMMP1和TgAMMP2的缺失会显著引起顶质体异常甚至丢失。研究表明弓形虫顶质体参与多种虫体代谢途径。血红素代谢途径是重要的弓形虫顶质体代谢途径之一，是潜在的药物靶点。为了探究弓形虫TgAMMP1和TgAMMP2的缺失是否影响弓形虫的血红素生成，本研究收集虫体对弓形虫血红素丰度进行测定。结果表明TgAMMP1和TgAMMP2缺失后虫体血红素丰度降低。弓形虫血红素合成的起始底物琥珀酰CoA是糖代谢中三羧酸循环代谢中的α-酮戊二酸的下游直接产物和琥珀酸的上游直接底物。因此本研究使用13C葡萄糖进行糖代谢流测定并分析代谢流差异。结果表明，TgAMMP1和TgAMMP2缺失导致α-酮戊二酸以及琥珀酸同位素标记比例显著下降，也导致糖代谢过程中其他物质代谢受到影响。TgAMMP1缺失可能抑制糖酵解和α-酮戊二酸的合成。TgAMMP2缺失可能促进了糖酵解，抑制了异柠檬酸向α-酮戊二酸的转化。 综上所述，本研究发现顶质体MFS家族TgAMMP1与P-ATPase家族TgAMMP2是弓形虫存活的关键分子，其通过参与调控代谢影响虫体生长，很可能是潜在的药物靶点。
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