摘要
中药何首乌是蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥块根，具有补肝肾、益精血、强筋骨、乌须发、延年益寿等功效。广东德庆产何首乌因为品质佳，传统上一直被认为是何首乌的主要道地产区，其何首乌的种质资源明显优于其它地方的何首乌野生或栽培品种。药材发挥药效主要依靠药材中的有效化学成分，课题组前期研究显示德庆产何首乌的种质资源优良与其所含的大黄素型蒽醌和二苯乙烯苷类化学成密切相关，《中国药典》2020版也将大黄素型的蒽醌类成分定为何首乌药材质量优劣的指标性成分之一。但目前关于何首乌药材中大黄素型蒽醌等有效成分生物合成途径的研究还比较少。为更好的探寻德庆产道地何首乌的种质资源优点，为德庆产优质何首乌种质资源保护与利用提供科学依据，本研究主要选择德庆产区的野生型和栽培型的何首乌作为研究对象，利用转录组测序技术，预测筛选何首乌中的大黄素型蒽醌类化合物生物合成路径中的基因，并结合CRISPR/Cas9基因打靶技术对这些基因进行编辑。旨在初步阐明与何首乌药材道地产区优质种质资源相关的大黄素型蒽醌类化合物生物合成途径中的关键基因，为何首乌种质资源的进一步改良提供理论支持。本研究主要的结果为：1.对何首乌的野生型与栽培型共七个样本进行转录组测序。对测序结果进行了拼接以及注释分析，经过差异分析共得到402个差异基因（DEGs）。对已识别的DEGs进行KEGG富集分析，根据蒽醌类化合物母核的生成途径结合KEGG的基因注释，发现何首乌中大黄素类化合物可能是经由莽草酸途径合成，其中的聚酮合酶（PKS）、脱羧酶（DC）可能是何首乌蒽醌类化合物合成的主要调控基因。通过筛选与这些酶密切相关基因，推测Unigene00 04212（FmPKSA）、Unigene0019385（FmSAMDC2）可能是参与大黄素的生物合成的主要调控基因。2.根据转录组测序数据，克隆得到一条FmPKSA基因以及FmSA MDC2基因，两者结构基因的完整CDS序列长分别为996 bp与1041 bp，共编码33 2个与347个氨基酸，对其进行了序列比对，并进行了生物信息分析。3.成功地构建了何首乌毛状根的培养体系。基于目标基因FmPKSA和FmSAMDC2序列的分析，设计了合适的sgRNA并进行了扩增验证。接着，构建了CRISPR/Cas9载体，并通过测序分析确认了成功构建并使用农杆菌ATCC15834进行转化。后续的毛状根诱导实验验证分析表明，何首乌中的基因FmPKSA以及FmSAMDC2基因可能对何首乌生长分化起到调控作用。 综上所述，本研究探讨了何首乌中的可能调控大黄素型蒽醌类化合物的合成路径。克隆获得一条FmPKSA、FmSAMDC2基因，在农杆菌介导的毛状根诱导培养体系中推测两个基因可能与何首乌的生长分化有关。
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