摘要
本研究通过马乳腺上皮细胞的体外培养及条件优化，利用外源添加氢化可的松（Hydrocortisone，HYD）、胰岛素（Insulin，INS）和表皮生长因子（Epidermal growth factor， EGF）探究其对马乳腺上皮细胞生长及功能的影响，并通过转录组测序，初步筛选母马泌乳和乳成分合成相关基因，为进一步揭示母马泌乳的机制问题提供参考依据。 选择健康的泌乳期哈萨克母马（2胎）乳腺组织，利用酶消化法分离培养马乳腺上皮细胞，并优化培养条件，探究单独及正交试验方法添加氢化可的松（0、1和5μg/mL）、胰岛素（0、5和10μg/mL）和表皮生长因子（0、5和10 ng/mL）对马乳腺上皮细胞活力及乳脂、乳糖和乳蛋白合成的影响，通过转录组测序，分析基因表达的情况。结果显示： （1）倒置显微镜下观察到细胞呈铺路石状或岛屿状；具备正常的“S”型生长周期；琼脂糖凝胶电泳和免疫荧光染色鉴定能表达Cytokeratin 18蛋白。 （2）在15%血清浓度时，细胞活力最好；在15%血清浓度条件下，单独添加1μg/mL的氢化可的松、5μg/mL的胰岛素和5 ng/mL的表皮生长因子细胞活力最好；正交试验结果表明，组合添加1μg/mL氢化可的松和5 ng/mL表皮生长因子时，细胞活力最佳。 （3）组合添加氢化可的松和表皮生长因子后，试验组和对照组相比，甘油三酯和乳糖浓度分别极显著提高了86.36%和33.33%（P＜0.01）；总蛋白浓度无显著性差异，但β-酪蛋白浓度显著提高了30.10%（P＜0.05）。 （4）通过转录组测序发现，显著上调的基因有596个，下调的基因有432个，包括层粘连蛋白亚基α-2（LAMA2）、层粘连蛋白亚基α-3（LAMA3）、层粘连蛋白亚基α-4（LAMA4）、层粘连蛋白亚基α-5（LAMA5）、层粘连蛋白亚基γ-1（LAMC1）、层粘连蛋白亚基γ-3（LAMC3）、Ⅳ型胶原α1链（COL4A1）、脂肪酸合成酶（FASN）和叉头框蛋白O1（FOXO1）等基因显著表达（P＜0.05）；GO功能富集分析主要集中在细胞粘附、生物粘附和细胞-细胞信号传导等28条目（P＜0.05）；KEGG通路富集分析主要集中在ECM与受体的互作和PI3K-Akt信号通路等23条信号通路（P＜0.05）。 综上所述，本研究通过酶消化法成功培养并鉴定出了马乳腺上皮细胞；单独及通过正交试验组合添加氢化可的松、胰岛素和表皮生长因子能够促进马乳腺上皮细胞活力以及乳脂、乳糖和乳蛋白的合成；通过转录组测序，初步筛选出了部分母马泌乳和乳成分合成相关基因，可为母马泌乳性能的进一步研究提供参考。
NETL