摘要
目的：牙周炎主要由菌斑堆积引起牙周软硬组织产生慢性炎症性疾病，进而导致组织破坏，最终致使牙齿的松动及脱落。多项研究发现，2 型糖尿病(Diabetes)的高糖环境可以促进牙周炎症的发生发展，加速牙周软硬组织的破坏。有研究表明，牙周炎的氧化应激环境可以激活FOXO1的积累。同时也有研究表明在2型糖尿病的炎症环境下， FOXO1可以活化并异位表达，与 TCF竞争结合 β-Catenin。新形成的FOXO1/β-Catenin复合物能够抑制经典 Wnt/β-Catenin信号通路影响成骨进程。然而，在伴 2 型糖尿病牙周炎的复杂环境的调控下，牙周组织的骨破坏机制仍需进一步探索。因此，我们试图通过建立高糖炎症体内和体外模型模拟伴2型糖尿病牙周炎的环境，探究FOXO1在其中的表达情况，以及FOXO1对于高糖炎症环境中hPDLCs的成骨分化进程的调控。 方法： 1. 将小鼠使用高脂高糖饲料喂养 8周后，按照 40 mg/kg 的剂量注射STZ溶液，每天 1 次，持续 5 天，来建立小鼠2型糖尿病模型，然后将结扎线置于实验小鼠的上颌第1、2磨牙牙间隙 9 天，用于建立实验性牙周炎模型，两周后处死。通过 Micro-CT 测量实验小鼠的结扎部位牙周硬组织的吸收水平；在结扎间隙处测定骨体积分数(BV/TV), 骨小梁厚度(Tb.Th)；测量釉牙骨质界到牙槽骨嵴顶(cementoenamel junction to the alveolar bone crest, CEJ-ABC)的距离，以此来观察牙周硬组织的破坏程度。通过免疫组化染色、RT-PCR和 Western blot 检测伴2型糖尿病牙周炎小鼠牙周组织中FOXO1的表达水平。 2. 离体牙分离、提取和培养 hPDLCs 后流式细胞术鉴定 hPDLCs表面标志物，并诱导成骨分化和成脂分化验证 hPDLCs 多向分化能力。 3. 分别用含 5 mM，15 mM，25 mM，35 mM，45 mM的葡萄糖浓度的完全培养基培养 hPDLCs，通过细胞计数 kit-8(CCK-8)对细胞增殖能力进行测定；使用 RT-PCR检测 FOXO1和成骨相关基因的 mRNA表达，采用 Western blot检测FOXO1和成骨相关蛋白的表达，ALP染色、茜素红染色鉴定成骨分化能力以筛选出明显抑制 hPDLCs 成骨分化能力的最适葡萄糖浓度。 4. 分别使用过表达FOXO1慢病毒和FOXO1抑制剂AS1842856处理 hPDLCs，采用 Western blot观察成骨相关蛋白表达，免疫荧光观察FOXO1和β-catenin细胞核表达水平。 5. 提取hPDLCs细胞核蛋白和细胞质蛋白，进一步观察FOXO1和β-catenin的核转位情况。在过表达 FOXO1的基础上使用 β-catenin通路抑制剂DKK-1处理细胞以观察其成骨分化能力，以及免疫荧光观察FOXO1和β-catenin的核定位水平。分别使用AS1842856和DKK-1分别处理 hPDLCs，观察成骨相关蛋白的表达和成骨分化能力，以及免疫荧光观察FOXO1和β-catenin的核定位水平。 结果：1. Micro-CT 观察到在小鼠伴2型糖尿病牙周炎模型中，牙周硬组织的吸收水平增加，骨小梁有所吸收，CEJ-ABC 距离增宽。Hamp;E染色、Masson染色观察到小鼠伴2型糖尿病牙周炎模型牙周组织形态变化。免疫组化、RT-PCR 和 Western blot 实验观察到小鼠模型中FOXO1的表达受到了高糖炎症环境的调控。 2. 离体牙分离培养筛选出 hPDLCs，通过光镜下观察其具有间充质干细胞基本形态，流式细胞术实验鉴定其间充质干细胞表面抗原为阳性，并进行了干细胞多向分化能力验证。 3. 体外诱导高糖炎症模型。通过浓度梯度实验，筛选出合适的葡萄糖处理浓度为45 mM，对应的成骨分化能力减弱最明显，FOXO1得以激活，成骨相关蛋白表达受到抑制。 4. 慢病毒转染过表达FOXO1基因和FOXO1抑制剂AS1842856分别处理 hPDLCs，过表达 FOXO1 基因后成骨相关蛋白表达增加，β-catenin的表达也受到FOXO1的调控，而加入抑制剂AS1842856可以逆转这种调控。同时过表达FOXO1会增加FOXO1的核转位，减弱β-catenin的核转位，AS1842856会减弱FOXO1的核转位，增加β-catenin的核转位。 5. Western blot检测FOXO1在受到过表达FOXO1的调控后以及在高糖炎症环境的刺激下，核转位的水平上调，AS1842856 可以逆转这个趋势。过表达FOXO1的基础上使用β-catenin通路抑制剂DKK-1处理后，过表达FOXO1促进的成骨作用被逆转，FOXO1和β-catenin的核转位均有下调。经 AS1842856 处理后，hPDLCs的成骨相关蛋白表达和成骨分化能力均有所下降，FOXO1 的核转位水平降低，而 β-catenin的核转位水平上调。使用DKK-1处理后的细胞在进行诱导后成骨分化能力降低，和抑制FOXO1后效果一致。FOXO1和β-catenin的核转位水平均受到抑制。 结论：1. 高糖炎症环境可以加重伴 2 型糖尿病牙周炎模型小鼠的牙槽骨吸收，并激活FOXO1在牙周组织中的表达。 2. 高糖炎症环境能够减弱 hPDLCs 的成骨分化能力，并上调FOXO1在hPDLCs中的表达水平。 3. 过表达FOXO1基因能够增强hPDLCs的成骨分化能力和成骨相关蛋白的表达，增加 FOXO1的核转位，并减弱 β-catenin的核转位，使用 AS1842856抑制 FOXO1的表达可以减弱 hPDLCs的成骨分化能力，提示FOXO1参与了在高糖炎症环境中的成骨分化的调控。 4. 在过表达 FOXO1基因的基础上使用β-catenin抑制剂 DKK-1可以减弱过表达FOXO1对成骨的调控作用，并逆转FOXO1的核转位趋势。使用AS1842856和DKK-1均能减弱hPDLCs的成骨分化能力，并减弱FOXO1和β-catenin抑的核转位水平。提示FOXO1的调控作用可能是通过介导β-catenin核质转位来完成的。
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