摘要
CRISPR/Cas12a系统是下一代诊断生物传感平台中的有力工具，新的激活方式的发现将极大地拓宽其应用范围。在该研究中，我们确定了两个新的 CRISPR/Cas12a系统激活方式：无PAM位点和粘性末端的DNA发夹和嵌合DNA-RNA单链。使用实时荧光检测的方法，证明了DNA发夹结构与Cas12a激活之间的强相关性。与以往报道的ssDNA和含PAM的dsDNA激活方式相比，DNA发夹激活方式同样具有较好的特异性和通用性。接下来，我们发现了嵌合的DNA-RNA单链可以不同程度地激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性，在此基础上，我们进一步将其分裂为两条短的ssDNA和RNA，当它们同时存在时，也具有较好的激活效果。目前，基于CRISPR/Cas12a的检测RNA靶标的方法需要通过预扩增策略先将RNA转化为DNA，这增加了检测的复杂性，针对这一研究现状，我们开发了分裂核酸激活的Cas12a（SNA-Cas12a）策略，成功实现了miR-155的直接检测。通过结合在crRNA间隔序列近端的ssDNA的辅助作用，我们突破了CRISPR/Cas12a不能被RNA靶标激活的限制。此外，利用crRNA的可编程性，优化了其与DNA和RNA结合的位置分布和长度，以实现激活Cas12a的最佳效率。SNA-Cas12a方法使得miR-155在pM水平上的检测成为可能。总之，两种新的激活方式的发现对于扩大CRISPR/Cas12a系统在生物传感策略开发中的应用具有重要的意义；同时，提出的基于Cas12a的RNA检测策略，简单、快速且特异，拓展了CRISPR/Cas12a的应用场景。
NETL