摘要
背景：急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是一种由肺部严重内皮功能障碍引起的呼吸系统疾病，在急性肺损伤中，过度炎症、组织水肿和免疫细胞内流会阻止内皮细胞再生，而内皮细胞再生对修复内皮屏障至关重要，肺血管内皮细胞再生在急性肺损伤不同时期都扮演着重要角色。然而，目前对ALI的内皮修复还没有有效的治疗方法。 胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7），也被称为血管调节蛋白，是一种分泌蛋白，IGFBP7已被发现在炎症性疾病（ALI）等疾病中发挥重要作用。然而，IGFBP7在ALI不同时期内皮细胞增殖中的作用尚不清楚。 方法：在本研究中，体外实验采用人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）在LPS给药前用SiRNA敲低IGFBP7预处理48小时，随后用LPS(5μg/ml)刺激24h，测定HUVECS细胞增殖及增殖相关基因表达。此外我们用hrIGFBP7蛋白干预细胞48小时，检测IGFBP7对HUVECS细胞增殖的影响。我们使用批量RNA测序来鉴定IGFBP7调控基因，并通过String and Genemania数据库筛选IGFBP7调控相关基因，并通过Western Blot，细胞免疫荧光实验技术进一步探究潜在作用机制。体内实验将体重在18-25g的C57BL/6J Aplnr-Dre雄鼠随机分为正常组（NC-PBSdpi）、病毒敲除肺血管内皮IGFBP7组（AAV-PBSdpi）、普通造模组（NC-LPSdpi）、病毒敲除肺血管内皮IGFBP7造模组（AAV-LPSdpi），为了探究IGFBP7在小鼠急性肺损伤不同阶段，对肺血管的影响有何不同，我们将以上四组分为造模一天、7天、14天、21天四个不同时间段获取肺组织标本，每组10只，所有实验鼠均采用Aplnr-Dre基因鼠，腹腔注射他莫昔芬（75mg/kg），注射7天，喂养一周后病毒敲除肺血管内皮细胞组尾静脉注射AAV病毒，并且处理组气道滴注LPS（5mg/kg）造模，其余组气道滴注等体积无菌磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS），根据时间要求喂养。获取肺组织前4小时对小鼠进行腹腔注射EDU（200mg/kg）,随后对小鼠肺组织进行免疫荧光观察肺组织内皮细胞增殖情况，使用WB验证IGFBP7在小鼠体内对内皮细胞增殖的作用通路是否和细胞一致表达水平。同时使用炎症人肺组织和正常人肺组织进行免疫荧光染色，共染CD31与IGFBP7/YAP/PYAP/TEAD1/TEAD4/C-FOS探究IGFBP7是否在人肺组织中也调节该通路。 结果：1.IGFBP7可促进内皮细胞的增殖和修复，在HUUVECS中，无论是正常组还是LPS损伤组细胞，敲低IGFBP7均会使内皮细胞增殖减弱。而使用hrIGFBP7干预细胞，可使HUVECS增殖增强。在体内实验中，敲除Aplnr-Dre小鼠肺血管内皮细胞IGFBP7，在急性肺损伤早期，敲除IGFBP7对肺血管内皮增殖无明显影响，而在急性肺损伤晚期。2.IGFBP7激活HUVECs中YAP/TEAD1-TEAD4/C-FOS信号通路。我们通过批量RNA测序来鉴定敲低IGFBP7后，HUVECS的YAP1基因表达下调，并通过String and Genemania数据库筛选IGFBP7调控相关基因发现了YAP1/C-FOS与IGFBP7高度相关，hrIGFBP7干预HUVECS后YAP、TEAD1、TEAD4、C-FOS蛋白表达量升高，然而SiRNA敲低IGFBP7后，HUVECS细胞无论是在正常状态还是炎症损伤状态下，YAP、TEAD1、TEAD4、C-FOS表达均被抑制。3.IGFBP7激活通过YAP/TEAD1-TEAD4/C-FOS信号通路促进内皮细胞增殖。使用YAPI抑制剂Verteporfin处理细胞后，IGFBP7对YAP/TEAD1-TEAD4/C-FOS信号通路的激活被抵消，并且细胞增殖被抑制。使用C-FOS抑制剂,IGFBP7对HUVECS细胞的增殖促进作用也被抵消 结论：IGFBP7可促进急性肺损伤晚期内皮细胞增殖，其潜在作用机制可能与通过激活YAP1介导的Fos转录因子信号通路，促进损伤后肺血管内皮细胞增殖相关。
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