摘要
番茄（Solanum lycopersicum L.），是茄科番茄属一年生草本植物，番茄果实中含有丰富的营养物质。新疆因得天独厚的光热条件使新疆番茄具有独一无二的品质优势。根结线虫（Root-knot nematode，RKN）病在新疆南北疆均有分布，尤其是设施番茄栽培中极为严重，番茄是RKNs的主要寄主之一，而RKNs的入侵可造成番茄减产甚至绝收。WRKY转录因子广泛参与植物生物和非生物胁迫及生长发育过程的调控。课题组前期利用RNA-seq筛选了6个在RKNs侵染关键时期的差异表达基因（Differentially expressed gene，DEGs），为进一步研究WRKY转录因子在番茄抗根结线虫病中的作用，本研究对上述筛选的6个DEGs进行生物信息学分析和表达模式验证，初步筛选出SlWRKY80在番茄防卫RKNs进程中可能具有重要的调控功能。基于此，利用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）和超表达技术进行SlWRKY80的功能验证，同时对SlWRKY80 超表达 T1代植株内源激素含量和 ROS 系统水平进行测定，以此验证SlWRKY80在番茄抗根结线虫病中发挥的作用以及可能参与的信号通路，以期为后续优质番茄品种的抗性改良提供宝贵的基因资源。主要研究结果如下： （1）通过生物信息学分析，RNA-seq筛选出的目标SlWRKYs预测均定位于细胞核，为非稳定亲水氨基酸；蛋白高级结构预测和系统进化树分析发现SlWRKY80与参与水稻、拟南芥生物胁迫的WRKYs高度同源，并且启动子顺式作用元件分析发现其含有w-box元件，同时还含有丰富的MeJA响应元件；组织特异性表达模式验证表明， SlWRKY80 在根和叶中的表达量明显高于其它 SlWRKYs；对抗病番茄‘Motelle ’ （Mi-1/Mi-1）接种M. incognita后，SlWRKY80在根部不同阶段的表达量显著高于感病番茄‘M82’（mi-1/mi-1），同时较其它SlWRKYs也呈现较高的表达水平差异。综上， SlWRKY80可能是番茄抗根结线虫病的调控因子。 （2）利用VIGS策略，成功获得抗病番茄‘Motelle’（Mi-1/Mi-1）和感病番茄‘M82’ （mi-1/mi-1）材料的SlWRKY80沉默植株，接种M. incognita后进行抗病性鉴定。结果表明，抗病番茄‘Motelle’（Mi-1/Mi-1）和感病‘M82’（mi-1/mi-1）番茄材料沉默SlWRKY80后均降低了对RKNs的抗性。抗病番茄‘Motelle’（Mi-1/Mi-1）病情等级由高抗（HR）发展到抗病（R）状态；感病番茄‘M82’（mi-1/mi-1）病情等级不变，为高感（HS）状态，但是根结数量增加，综上，初步判定SlWRKY80在番茄抗根结线虫病过程中作为正调控因子发挥作用。 （3）亚细胞共定位和超表达株系的抗病性鉴定结果显示，SlWRKY80定位于细胞核，遗传转化感病番茄‘M82’（mi-1/mi-1）获得超表达株系，选择SlWRKY80表达水平较高的株系自繁后获得T1代番茄植株，接种M. incognita后进行抗病性鉴定。结果表明：WT番茄植株病情等级为高感HS （ DI=87.5 ） ，而T1代番茄植株病情等级为感病S （DI=62.5）；综上，超表达SlWRKY80后可提高番茄植株的抗性，进一步说明该基因正反馈调节番茄对RKNs的抵抗。 （4）由于SlWRKY80可正向积极调控番茄植株的抗性，在对T1代和WT番茄生长生理指标测定后发现，超表达植株的茎粗、地下部干重鲜重、根系活力、叶片可溶性蛋白和可溶性糖含量较WT植株均有所提高；内源SA/JA测定表明，SA和JA激素信号在‘Motelle’（Mi-1/Mi-1）番茄中被诱导积累，表明其可能在Mi-1介导的抗性通路中发挥重要作用，而SlWRKY80也能够被外源喷施的SA和JA诱导上调表达；同时SA、JA、ETH和ABA含量在T1植株接种后的48 h被快速诱导并大量积累，积累水平显著高于WT番茄；同样的，ROS和H2O2在T1番茄根部接种后0-48 h迅速积累，同时，清除酶POD活性被快速诱导升高，SOD和CAT活性快速降低，最终T1番茄内ROS系统的增长速率在后期趋于平缓。综上表明：SlWRKY80可能通过不同程度介导激素信号，如SA、JA和ETH等及ROS系统信号途径参与番茄防卫RKNs的入侵。
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