摘要
背景：非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD），一种在全球范围内普遍存在的慢性肝脏代谢性疾病，已经引起了全球医学界的广泛关注。根据最新的流行病学调查显示，全球NAFLD的患病率约为38%，因此研究人员预测NAFLD将在未来成为导致肝脏终末期疾病的主要因素。虽然已有大量关于 NAFLD 治疗机制的研究，但其发病机制尚未完全阐明，且目前没有针对 NAFLD 的特效药物获得批准上市。近年来，人参皂苷 Rg1（Ginsenoside Rg1， GRg1）因其在NAFLD治疗中涉及多靶点和多机制的复杂药理特性而成为研究焦点。先前的基础研究显示，GRg1在NAFLD小鼠模型和细胞模型中均显示出了低毒性和有效缓解疾病的特性。然而，这些研究未采用网络药理学、分子对接、分子动力学模拟等生物信息学技术，从宏观角度深入探索GRg1治疗NAFLD的多靶点和多通路机制。 目的：本研究采用网络药理学方法筛选 GRg1 在 NAFLD 治疗中的关键作用机制及其差异基因靶点，然后通过分子对接技术与分子动力学模拟对这些差异基因靶点的可靠性进行验证分析。我们希望本研究能够为GRg1在NAFLD治疗领域的应用提供更加坚实的理论基础。 方法：首先，采用 TCMSP 和 PharmMapper 数据库筛选并确定GRg1 的作用靶点，并通过 GeneCards 和 DisGeNET 数据库识别NAFLD的相关治疗靶标。利用Uniprot数据库对药物和疾病的作用靶点集进行标准化校正，并通过 Venny 2.1 在线工具获得 GRg1 作用于NAFLD的潜在靶点。 随后，对于获得的潜在靶点，利用 STRING 11.5 数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction ，PPI），并应用DAVID数据库进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路注释，以筛选出GRg1对NAFLD起治疗作用的关键靶点和通路。通过微生信云平台对上述分析数据进行可视化处理，并利用Cytoscape3.9.1软件描绘GRg1、潜在靶点、KEGG关键通路、NAFLD间的相互作用网络图。综合上述分析，结合各部分筛选条件，最终确定差异基因靶点。 最后，应用AutoDock对差异基因靶点与GRg1的结合紧密性进行评估并获得最优构象。接着采用GROMACS 2019.6软件再对最优构象进行分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟验证，通过对最优构象复合物的均方根偏差（root mean square deviation ，RMSD）、均方根波动（root mean square fluctuation，RMSF）和氢键（hydrogen bonds）的相互作用情况等数据的分析评估差异基因靶点与GRg1的结合动态稳定性。 结果：首先，本研究获得 294 个 GRg1 药物靶点和 1293 个与NAFLD相关的疾病靶点，交叉分析后获得89个GRg1作用于NAFLD的潜在靶点。 随后，通过对潜在靶点进行 PPI 网络拓扑分析获得 10 个关键靶点，它们包括：HSP90AA1、RXRA、AKT1、HRAS、ESR1、EGFR、AR、IGF1、PPARA 和 NOS2，这是后续差异基因靶点筛选的第一个条件。通过对潜在靶点 GO 富集分析发现药物作用的生物过程与细胞凋亡过程的负调控密切相关，这一过程与 NQO1、GSK3B、GSK31、GSTP1、NR1H4、IGF1、MIF、SOD2、MMP9、EGFR、TGFBR1、IGF1R、MAPK8、ERBB4、CASP3、ALB、MDM2和AKT1等17个基因密切相关，这是差异基因靶点筛选的第二个条件。通过KEGG通路注释分析发现 GRg1 可能通过胰岛素抵抗、内分泌抵抗、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路以及雌激素、PI3K/Akt和MAPK等关键通路，对 NAFLD 发挥治疗作用。通过药物疾病靶点网络图对于潜在作用靶点和KEGG关键通路进行再次网络分析后得出与KEGG关键通路相关的前 10 个靶点成为差异基因靶点的第三个筛选条件，包括AKT1、HRAS、EGFR、NQS3、MAPK8、MAPK14、PRKACA、IGF1R、IGF1 和 MMP2。使用 Venny 2.1 对上述 PPI 网络拓扑分析、GO 分析和 KEGG 分析得出的三种筛选条件进行再次分析后，筛选出三个差异基因靶点：AKT1、EGFR和IGF1。 最后，通过分子对接技术，AKT1-GRg1 的最低结合能最低为﹣8.2 kcal/mol，EGFR-GRg1为﹣6.9 kcal/mol， IGF-1为﹣6.4 kcal/mol。在分子对接最优构象的可视化图形中，GRg1和AKT1之间建立了3个氢键连接AKT1中的Ser240、Glu341和Tyr350等氨基酸残基，GRg1在EGFR中的Arg841、Asp837和Cys797等氨基酸残基处建立了3个氢键；GRg1与IGF1的三个氨基酸残基Glu57、Asp60和Ser45等共形成4个氢键。通过分子动力学模拟技术，AKT1-GRg1、EGFR-GRg1和IGF1-GRg1的平均RMSD值及其标准差分别为0.335198±0.034518 nm、0.359897±0.049747 nm 和 0.763057±0.072185 nm，在此部分排除了不稳定的 IGF1。在分子动力学的其他动力学参数中，AKT1-GRg1和EGFR-GRg1的平均RMSF值及其标准差分别为0.149114 ± 0.071838 nm和0.172353 ± 0.089464 nm；AKT1-GRg1 配合物在整个模拟过程中形成了3374个氢键相互作用且几乎全程形成氢键，而EGFR-GRg1配合物的氢键相互作用数量为2325个。 结论：本研究通过网络药理学筛选得出 GRg1 可能通过作用于AKT1、EGFR 和 IGF1 等差异基因靶点发挥治疗 NAFLD 的效果，其潜在的作用机制包括调节胰岛素抵抗、内分泌抵抗、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号、雌激素、PI3K-Akt和MAPK信号通路和凋亡过程的负向调控等途径。通过分子对接和分子动力学验证结果表明IGF1与GRg1结合良好但不稳定而被排除，AKT1和EGFR与GRg1的对接复合物间具有较好的结合活性且均能展现良好的稳定性，再次验证了GRg1可作用于AKT1和EGFR对 NAFLD产生有效的缓解治疗效应。
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