摘要
据报道，肺癌几乎占全球癌症死亡人数的五分之一。在过去的几十年里，癌症在病因、预防、早期发现、诊断、治疗、生存等方面取得了实质性进展。然而，由于技术手段不足及人们心理状态等因素的影响，肺癌的筛查率严重不足，预后效果不佳。在整个21世纪，肺癌仍将是全球主要的公共卫生负担。因此，需要新的治疗策略来改善肺癌患者的预后。现代药理学研究显示，半枝莲、龙葵可使清热解毒、消肿抑瘤之力增强，炒白术兼取平衡阴阳和药性的功能。因此，根据非同类配伍中阴阳气血以及脏腑相关的理论，半枝莲-龙葵-炒白术配伍使用，符合中医治疗肺癌扶正祛邪、滋阴清热的基本原则，利用药物作用上的沟通互补，将主要功效不同的药物配伍用药以增强中药联合使用的效果。但是复方中药机理研究表浅，目前半枝莲-龙葵-炒白术复方（SSA）抗肺癌的分子机制尚不明确。 目的： 基于网络药理学和体内外实验探讨SSA及其关键成分槲皮素和白术内酯Ⅱ对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，并探索其作用机制。 方法： 1 ．网络药理学方法探究SSA发挥抗肺癌作用的分子机制。利用TCMSP、SwissTargetPrediction、PharmMapper等数据库，检索半枝莲、龙葵和炒白术的潜在有效成分及作用靶点；利用GenCards数据库得到疾病靶点，绘制“有效成分-靶点”网络图；将成分靶点与疾病靶点相映射，交集靶点即为SSA发挥抗肺癌作用的潜在靶点；为明确潜在靶点之间的相互作用关系，将交集靶点构建PPI网络，并将分析结果导入Cytoscape软件进行可视化分析，根据Degree值对SSA抗肺癌的关键靶点进行预测；利用Metascape数据库进行GO及KEGG富集分析，探讨SSA最可能发挥抗肺癌作用的潜在机制。利用 AutoDock vina 1.5.6软件进行分子对接，并根据结合能对网络药理学的预测结果进行验证。 2 ．通过体内外实验探讨SSA对肺癌细胞的影响。利用CCK-8实验探讨不同浓度的SSA提取物对肺癌细胞株A549 （人源）和LLC （鼠源）增殖活性的影响；细胞划痕实验探讨SSA对肺癌A549细胞迁移的影响；Transwell实验检测 SSA对肺癌细胞 A549侵袭的影响；采用 Western blot实验检测SSA对A549细胞Bax、Bcl-2以及PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平的影响。建立C57BL/6小鼠皮下异种移植瘤模型，随机分为5组并给予对应药物，在给药过程中密切监测肿瘤体积及小鼠重量，解剖后称取肿瘤重量，进一步评价SSA的体内抗肿瘤活性。 3．通过细胞实验探讨SSA关键成分槲皮素和白术内酯Ⅱ的体外抗肿瘤活性。利用 CCK-8实验探讨不同浓度的槲皮素和白术内酯Ⅱ 1∶1配伍使用与单独使用相比的抗增殖活性；通过细胞划痕实验和Transwell实验研究槲皮素和白术内酯Ⅱ联合使用对细胞转移的影响；Western blot实验检测槲皮素和白术内酯Ⅱ联合使用对PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响。 结果： 1.通过TCMSP、SwissTargetPrediction、PharmMapper等数据库筛选出 47个 SSA治疗肺癌的有效成分，对应 277个作用靶点；GeneCards数据库筛选得到疾病靶点1511个；借助Venn绘图工具获得潜在作用靶点 144个；利用 Cytoscape3.9.1软件中的“Analyze Network”工具筛选出核心靶点78个；KEGG富集分析主要涉及癌症相关通路、PI3K/Akt信号通路、脂质与动脉粥样硬化、IL-17信号通路等。综合网络药理学预测及文献调研，猜测 SSA作用于肺癌主要的信号通路为PI3K/Akt信号通路。“SSA成分-靶点网络”中度值最高的10个化合物分别为槲皮素、白术内酯Ⅶ、白术醚、4R，15-环氧白术内酯Ⅱ、双白术内酯、8-表白术内酯Ⅱ、木犀草素、8-表白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅳ和汉黄芩素；“SSA抗肺癌潜在靶点PPI网络”中度值前5的节点为TP53、AKT1、EGFR、TNF和IL-6；“SSA通路-靶点网络”中度值前五的节点为AKT1、RELA、CHUK、MAPK1和NFKBIA。将上述10个活性成分与9个关键靶点进行分子对接，发现均具有一定的结合活性；2.体外实验结果表明，SSA可以有效抑制肺癌细胞A549和LLC增殖且具有剂量依赖性，48 h的半数抑制浓度（IC50）为 203.1、310.9 μg/mL；与对照组相比，SSA处理组的细胞迁移距离明显减小，侵袭进入下室的细胞数目明显变少；SSA处理组的A549细胞中，促凋亡蛋白Bax表达上调，抗凋亡蛋白 Bcl-2表达下调；此外，Western Blot实验结果表明，SSA可以抑制A549细胞中PI3K/Akt通路中p-PI3K和p-Akt的表达水平。体内实验结果显示，SSA能有效抑制小鼠肿瘤生长，且小鼠体重较空白组没有明显差异；3.CCK-8实验结果显示，槲皮素和白术内酯Ⅱ在 50-200 μM对肺癌细胞A549和LLC有抑制作用且呈浓度依赖性，两者1∶1配伍与单独给药相比抗增殖作用明显增加；细胞划痕实验和Transwell实验显示，槲皮素、白术内酯Ⅱ对细胞的迁移和侵袭均有适度的抑制作用，当两者联合使用后，抗转移作用明显增加。此外，Western Blot实验结果显示，槲皮素对p-PI3K和p-Akt蛋白表达有一定的抑制作用，白术内酯Ⅱ对蛋白表达没有显著作用，当两者联用后，p-PI3K和p-Akt蛋白的相对表达量显著降低。 结论： 网络药理学分析结果预测了SSA主要是通过PI3K/Akt信号通路发挥抗肿瘤作用，分子对接结果揭示了SSA抗肺癌作用的多成分、多靶点、多途径特征。此外，本研究通过体内外实验验证了SSA治疗肺癌的有效成分和分子机制并为今后新型抗肺癌药物的研究提供了有价值的思路和参考。
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