摘要
蛋白泛素化修饰是蛋白翻译后修饰重要形式之一，参与蛋白质命运决定与生物学功能调控。蛋白自身泛素化状态主要由泛素连接酶-蛋白酶体系统和与之拮抗的去泛素化酶（Deubiquitinase，DUB）共同维持平衡。肿瘤中蛋白泛素修饰失调显著促进了致癌蛋白的异常累积和抑癌蛋白的快速降解。含 PDZ 结合基序的转录共激活因子（Transcriptional Coactivator with PDZ-binding Motif，TAZ）是Hippo通路下游重要效应分子，其表达丰度上调、核定位异常和转录调控失调等与包括头颈鳞状细胞癌（Head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC，以下简称头颈鳞癌）在内的多种恶性肿瘤发生进展密切相关。目前研究证实：TAZ是恶性肿瘤主要驱动致癌基因之一，也是富有临床转化潜力的分子标记物和治疗靶点。近来研究提示：头颈鳞癌中 TAZ 蛋白降解失调导致其异常累及促进肿瘤进展。已知 E3 泛素蛋白连接酶含 β-转导素重复序列（Beta-Transducin Repeat Containing E3 Ubiquitin Protein Ligase，β-TRCP）介导 TAZ蛋白泛素化修饰和降解。然而，负责 TAZ 去泛素化修饰并稳定促进其蛋白稳定的去泛素化酶尚不明确。本研究旨在筛选鉴定头颈鳞癌中 TAZ 蛋白特异性去泛素化酶，深入揭示其中相关分子机制，并探索靶向去泛素化酶治疗头颈鳞癌的可行性与有效性。 第一部分：去泛素化酶文库筛选头颈鳞癌TAZ蛋白去泛素化酶 目的：应用去泛素化酶文库筛选策略筛选鉴定头颈鳞癌中 TAZ 蛋白特异性去泛素化酶，并通过系列体外实验初步功能证实。 方法：1）利用去泛素化酶siRNA和cDNA质粒过表达文库体外互补筛选、筛选TAZ特异性去泛素化酶候选分子；2）通过基因沉默/过表达、去泛素化酶化学抑制、蛋白酶体抑制剂挽救以及荧光素酶报告等实验证实候选去泛素化酶分子参与TAZ蛋白去泛素化修饰；3）通过放线菌酮蛋白半衰期实验检测候选去泛素化分子对TAZ蛋白稳定性的调节作用。 结果：1）通过多轮DUB文库细胞体外筛选确定泛素特异性蛋白酶7（Ubiquitin-specific protease，USP7）是头颈鳞癌中参与 TAZ 蛋白稳定调控的主要去泛素化酶分子；2）细胞中siRNA介导USP7沉默可显著下调TAZ蛋白丰度以及下游靶基因转录；外源性USP7过表达可促进TAZ蛋白表达上调；USP7小分子抑制剂下调TAZ蛋白表达；USP7沉默诱导的TAZ蛋白下调作用可被MG-132处理所部分逆转；USP7 基因沉默或化学抑制不改变 TAZ mRNA 以及 Hippo 通路上游成员的表达水平；3）USP7沉默或活性抑制显著加速TAZ蛋白的降解（P＜0.05），而USP7外源性过表达则延长TAZ蛋白半衰期（P＜0.05）。 结论：通过去泛素化酶文库体外筛选和功能实验鉴定发现USP7是头颈鳞癌中参与TAZ蛋白稳定调控的主要去泛素化酶分子。 第二部分：USP7调控头颈鳞癌恶性表型 目的：检测USP7在头颈鳞癌组织中的表达、临床意义与患者预后的关联性，明确其在头颈鳞癌恶性表型调控中的作用，揭示TAZ作为重要中介分子参与USP7所介导的头颈鳞癌恶性表型。 方法：1）收集癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和高通量数据表达库（Gene Expression Omnibus，GEO）等公共数据库资源，应用生物信息学数据分析多组头颈鳞癌标本中 USP7 mRNA 的表达；2）通过免疫组织化学染色检测USP7在头颈鳞癌患者临床标本中的表达，并分析其表达与临床病理参数间的相关性；3）分析 USP7 表达与患者生存预后间的关联性，通过单因素、多因素回归分析确定 USP7 表达在患者预后判断中的价值；4）通过单基因基因富集分析算法分析TCGA-HNSC队列中USP7高/低表达标本中差异基因富集的通路/生物学过程；5）设计siRNA沉默USP7，通过克隆形成、CCK-8实验检测肿瘤细胞增殖变化；通过划痕、Transwell侵袭实验检测肿瘤细胞迁移、侵袭能力及相关分子表达；6）构建HNSCC皮下荷瘤动物模型，观察USP7沉默细胞在体内肿瘤形成能力；7）在USP7稳定敲减稳定细胞株中导入外源性过表达TAZ进行挽救实验，观察细胞表型改变。 结果：1）在 TCGA 口腔鳞癌和 GSE25093 两组队列肿瘤样本中 USP7 mRNA表达显著高于正常粘膜组织（P=0.0042；P=0.0003）；2），USP7在头颈鳞癌肿瘤组织中呈异常高表达，其表达水平与肿瘤大小（P=0.0002）、颈淋巴结转移（P=0.0002）和临床分期（P＜0.0001）显著相关。3）USP7高表达与患者总体低生存率显著相关；单因素Cox回归分析结果显示USP7免疫组化评分（P=0.001）、颈淋巴结转移（P=0.005）、肿瘤大小（P=0.010）和临床分期（P＜0.001）是患者不良预后的风险因素；多因素Cox回归分析结果显示USP7免疫组化评分可作为患者预后判断的独立因素（HR [95% CI]= 1.786 [1.002-3.184]，P=0.049）；4）在 USP7 高表达标本中差异基因显著富集于多个肿瘤相关生物学过程/通路（P＜0.0001）；5） siRNA 介导 USP7 沉默后肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力显著降低，E-cadherin mRNA表达上调，Vimentin mRNA 表达下调（P＜0.05）；6）USP7 沉默后肿瘤细胞体内生长显著减慢（P＜0.05），Ki-67和TAZ染色强度显降低（P＜0.05）；7）外源性TAZ过表达能部分逆转USP7沉默所致的细胞表型改变； 结论：在头颈鳞癌中USP7呈异常高表达，与肿瘤恶性特征、细胞恶性表型以及患者预后相关；TAZ是USP7参与头颈鳞癌恶性表型调控的重要中介分子。 第三部分：USP7去泛素修饰TAZ蛋白促其稳定的分子机制 目的：深入探索 USP7去泛素修饰 TAZ蛋白的结构基础、分子机制，明确催化移除泛素底物时所在亚细胞定位，观察USP7与β-TRCP对TAZ蛋白修饰的拮抗效应。 方法：1）采用免疫荧光检测USP7与TAZ在头颈鳞癌细胞中的亚细胞定位；2）利用蛋白质免疫共沉淀、蛋白纯化体外结合实验直接检测 USP7与 TAZ的蛋白互作；3）分别构建USP7及TAZ短截义突变，通过co-IP实验鉴定两者蛋白结合所需的主要区段；4）构建USP7失活突变（USP7C223S）检测其对于TAZ半衰期、转录因子结合能力以及表达变化；5）通过泛素-co-IP 实验检测 USP7 对于TAZ的去泛素修饰效应；6）通过泛素-co-IP实验观察P5091及GNE6640在不用浓度和处理时间下USP7不同抑制效率对TAZ泛素修饰状态的影响；7）通过泛素-co-IP 检测 USP7 去泛素修饰 TAZ 蛋白泛素底物偏好性；8）应用外源性 β-TRCP过表达、激动剂C6神经酰胺处理、过表达Hippo通路上游组份等手段检测USP7与β-TRCP对TAZ泛素化状态的拮抗作用；9）通过泛素-co-IP检测TAZ在rhTGF-β1快速核转位或莱普霉素出核阻滞状态下泛素状态；10）构建TAZ核转位突变之列（TAZ4SA）通过双荧光素酶报告、泛素-co-IP、核浆蛋白提取等手段明确USP7 对 TAZ 去泛素修饰发生的亚细胞定位；11）通过 Western Blot、免疫荧光以及核浆蛋白提取等检测USP7沉默或化学抑制后TAZ亚细胞分布。 结果：1）Cal27和Fadu细胞中USP7和TAZ蛋白均共定位于细胞核；2）co-IP及体外结合实验证实USP7与TAZ蛋白互作；3）TAZ能与USP7氨基末端短截义（1-208aa）结合，而其他两个短截义突变不能结合； USP7 能与 TAZ全部短截突变结合；4）USP7C223S失活突变不改变 Cal27 中内源性 TAZ 蛋白的降解速率，不影响TAZ介导的下游转录；5）外源性USP7直接参与内源性TAZ的去泛素修饰过程，且能对TAZ全部主要区段去泛素化；6）GNE6640对USP7有更高的抑制效率（＜2μM）及更快起效时间（＜6小时）；7）USP7对TAZ去泛素修饰底物主要为K48多聚泛素链，而非K63多聚泛素链；8）β-TRCP外源性过表达或激动剂（C6神经酰胺）处理能下调Cal27细胞中TAZ蛋白表达，而此效应能被USP7过表达所逆转；β-TRCP外源性过表达、激动剂处理或Hippo通路上游组分外源性过表达条件下，β-TRCP对TAZ的泛素修饰效应均能被USP7高效拮抗。 结论：头颈鳞癌中 USP7与 TAZ蛋白在胞核中发生直接结合，对其进行去泛素化修饰促进蛋白稳定、胞核滞留；USP7与β-TRCP相互拮抗维持TAZ蛋白泛素化水平。
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