生殖细胞特化核糖体调控雄性生育力的研究

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中文摘要：核糖体是细胞内蛋白质合成的非常精密的分子机器。它的主要功能是将信使RNA（mRNA）翻译成机体所需要的蛋白质，即将遗传密码转换为氨基酸序列并从氨基酸单体构建蛋白质聚合物。除此之外，共翻译折叠的理论也提出核糖体对新生肽链的共翻译折叠是体内折叠的第一步，可以有效避免错误折叠或凝集来提高折叠效率，但其具体机制目前尚不清楚。研究表明核糖体是异质的，在蛋白质生物合成的调节中显示出组织特异性功能。一个核糖体蛋白水平的下调会选择性地损伤一个子集mRNA的翻译，提示异质性的核糖体对特定子集的mRNA来说具有不可替代的翻译作用。例如，含有RPL10A/uL1和RPS25/eS25的核糖体在小鼠胚胎干细胞(mESC)中翻译不同的mRNA池；RPL22和RPL22L1都掺入核糖体，RPL22L1蛋白的上调与结直肠癌预后不良相关；Rpl38基因的突变导致了小鼠表现出更短的尾巴、多出的肋骨和其他解剖缺陷等等。然而，核糖体异质性的精确调控机制仍然知之甚少，需要对核糖体构型的组织特异性变化进行系统的结构-功能分析。为了确认生殖细胞中存在特殊的核糖体，本课题前期取材了成年小鼠的9个组织以及小鼠4个睾丸发育阶段的样品，分别进行单聚核糖体（80S）的蛋白质组学定量分析。质谱检测到了5个核心RPs的旁系同源蛋白，我们发现从中发现了组织特异表达的RPs，包括心肌和骨骼肌限制表达的核糖体大亚基蛋白RPL3L，以及睾丸特异表达的核糖体蛋白RPL10L和RPL39L（Ribosomal Protein L39-like）。随着生殖细胞的发育，RPL10L和RPL39L的蛋白水平逐渐增加，而其对应的核心RPs RPL10和RPL39的表达水平逐渐降低，两者呈现出互补的表达模式。以上结果表明，睾丸中有特化核糖体（Ribosome with specific tunnel, RibosomeST）的存在。我们选取了睾丸特异表达核糖体蛋白RPL39L进行深入的RibosomeST功能研究。通过构建Rpl39l敲除小鼠，我们发现RibosomeST缺陷的三个敲除品系小鼠均表现为明显的睾丸尺寸减小，睾丸体重比值降低，精子头尾畸形比例增加，严重亚生育能力，以及累积存活小崽数量减少。敲除后小鼠精母细胞的蛋白质组并未受到的影响，但是表现为明显长形精子细胞（ESs）蛋白质组紊乱。我们利用一系列实验排除了转录水平和翻译活性改变导致蛋白质组紊乱的可能性。综合以上结果，我们认为RibosomeST敲除后，部分精子蛋白质的折叠异常，导致其稳定性下降蛋白加速降解，使Rpl39l敲除小鼠ESs蛋白水平紊乱，从而影响雄鼠的精子形成。为了进一步证实RibosomeST的存在，我们分别纯化出了小鼠睾丸组织和肾脏组织的核糖体颗粒，并通过冷冻电镜对两种核糖体结构进行解析。我们发现睾丸RibosomeST形成更大的新生多肽出口通道（NPET），其通道正电荷较少，柔性更强。而下调蛋白多为睾丸特异表达的精子蛋白，表现出更高的等电点（pI）、电荷、疏水性以及序列上的半胱氨酸富集。以上结果说明RibosomeST的NPET更适合精子细胞中睾丸特异表达的新生多肽子集的折叠加工。接下来，我们利用 CHX Chase 和 SDS 抗性测定实验确认了 RibosomeST缺失后导致新生蛋白的折叠异常，蛋白稳定性下降，降解速度加快。补充了完整的RPL39L或RPL39L的第28号氨基酸后可以挽救这种蛋白稳定性下降的表型。以上结果说明了异质性核糖体对靶标蛋白质折叠有重要的调控作用，并且RibosomeST和核心核糖体（RibosomeCore）有完全不同的生理功能，两者之间不可相互替代。综上所述，我们从蛋白质组学和冷冻电镜的结构解析两个方面证实了睾丸中存在特化的核糖体。RibosomeST的 NPET 更适合于精子细胞中带正电的新生多肽子集的折叠加工。RibosomeST通过共翻译折叠参与精子形成的蛋白质子集，赋予其更高的稳定性维持正常精子的形成。我们不仅打开了核糖体异质性的结构研究领域，更是通过 RibosomeST解决了长期以来困然大家的精子蛋白质如何在其生命周期中保持功能和稳定性的问题。

作者：

李会玲

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关键词：

生殖细胞特化核糖体新生多肽出口通道共翻译折叠精子形成生育力

授予学位：

博士

学科专业：

生殖医学

导师：

沙家豪

学位年度：

2023

学位授予单位：

南京医科大学

语种：

中文

中图分类号：