摘要
结核病（Tuberculosis）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium Taberculosis，MTB）引起的慢性传染性疾病，致死率极高，始终是公共卫生和人类健康的巨大威胁。世界卫生组织发布的《全球结核病报告》指出，结核病每年新增病例约10万人，且在2022年至2023年期间上升7.1%。作为结核病高负担国家之一，我国结核病的预防和控制面临着新的挑战。 卡介苗（Bacille Calmette-Guérin vaccine，BCG）自 1921 年发明至今，是全球唯一的结核病预防疫苗，但随着时间推移，其预防结核病的不足日益明显，其保护效力根据地域和人群等有较大差异。研究表明，这可能与卡介苗缺失的一段毒力基因缺失区（Region of Difference，RD）有关。RD区共分为16个区，由129个基因组成。目前研究普遍集中在RD1区与RD2区的单个关键蛋白或关键蛋白组合。虽然多种新型疫苗（重组卡介苗、亚单位疫苗等）相继出现，但迄今为止还没有找到一个根治结核病的新途径及一种能够有效替代卡介苗的新疫苗。因此，本研究利用NetMHCpan-4.1、NetMHCⅡpan-4.0、Bepipred、VaxiJen与ToxIBTL分析网站对结核分枝杆菌RD区编码的129个蛋白进行生物信息学分析，对 MHC Ⅰ 类 T 细胞表位、MHC Ⅱ 类 T 细胞表位、B 细胞线性表位、表位抗原相似性强弱与表位毒性强弱进行预测分析，根据预测分析结果筛选出5个优势蛋白Rv3871， Rv3874，Rv3875，Rv3879c，Rv3401与3个劣势蛋白Rv1986，Rv2074，Rv2660c，以H37Rv标准菌株基因为模板扩增出8个蛋白相对应目的基因后，将其构建于PMV361-eGFP整合载体中。获得8个重组质粒后，通过电转化的方法将其转入BCG中，得到8种重组卡介苗。成功构建 8 种重组卡介苗后，通过重组卡介苗侵染小鼠巨噬细胞RAW 264.7，观察其对RAW264.7炎症因子、细胞周期、细胞自噬、活性氧的影响，初步探究RD区蛋白的表位数量与免疫效应间的关系。 主要研究结果如下： （1）利用NetMHCpan-4.1、NetMHCⅡpan-4.0、Bepipred、VaxiJen、ToxIBTL预测网站，对结核分枝杆菌RD区129个编码蛋白的FASTA序列进行预测，并通过对表位数量的多少，表位毒性强弱及表位抗原相似性强弱几个方面进行筛选，以表位数量多，表位抗原相似性强，毒性低为筛选条件，最终筛选出Rv3871、Rv3874、Rv3875、Rv3879c、Rv3401 5 个优势的优势蛋白与 Rv2074、Rv1986、Rv2660c 3 个劣势蛋白。 （ 2 ）成功获得 8 个蛋白的基因片段，利用整合载体成功构建 rBCG-Rv3871、rBCG-Rv3874、rBCG-Rv3875、rBCG-Rv3879c、rBCG-Rv3401、rBCG-Rv2074、rBCG-Rv1986、rBCG-Rv2660c 8 种重组卡介苗，且重组卡介苗菌株与标准卡介苗菌株在同一培养条件下，重组卡介苗菌株能够正常生长，与卡介苗菌株生长周期相似，同时具有侵染巨噬细胞的能 力。 （3）BCG 及 8 种重组卡介苗体外侵染小鼠RAW 264.7 巨噬细胞实验结果显示：与对照组相比rBCG-Rv3871、rBCG-Rv3874、rBCG-Rv3875、rBCG-Rv3879c、rBCG-Rv3401组 G1 占比显著提高（P ＜ 0.05），S 期占比较对照组降低，差异显著（P ＜ 0.05）；与对照组相比rBCG-Rv3874、rBCG-Rv3875、rBCG-Rv3871、rBCG-Rv3879c、rBCG-Rv3401组产生的活性氧显著增多（P ＜ 0.05）；与对照组相比 rBCG-Rv3874 产生的细胞自噬结果最为 显 著 （ P ＜ 0.05 ）； 与 对 照 组 相 比 rBCG-Rv3871 、 Rv3874 、 rBCG-Rv3875 、rBCG-Rv3879c、rBCG-Rv3401 组 INF-γ表达水平显著升高（P ＜ 0.05）。 综上，本研究利用生物信息学的方法成功预测出结核分枝杆菌RD区129个编码蛋白表位间数量关系，利用PMV361-eGFP整合载体将筛选出的8个基因成功转入卡介苗中。通过侵染小鼠 RAW 264.7 巨噬细胞相关实验，初步探究了结核分枝杆菌 RD 区编码蛋白表位与免疫原性间的关系，为结核病疫苗的研制奠定基础。
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