摘要
软骨缺损是骨科领域常见疾病之一。目前常见的治疗方法包括自体软骨移植、自体软骨细胞移植和微骨折术等。虽然这些方法在一定程度上有助于恢复患者的关节功能，但也存在诸多不足之处，使得软骨缺损的治疗成为临床上的重大挑战。自体软骨移植可提供与缺损部位相匹配的软骨，但供体部位有限，且存在供体部位功能障碍的风险。自体软骨细胞移植虽然避免了供体部位的问题，却需要进行二次手术，且移植后的软骨细胞成活率较低。微骨折术（Microfracture， MF）被认为是修复小面积软骨缺损的“金标准”，但修复的软骨为纤维软骨，与正常软骨在力学性能和耐磨性上存在差异。近年来，3D打印支架以其独特的结构设计和良好的生物相容性，为细胞的生长和分化提供了理想的条件，为软骨缺损的修复提供了潜在的解决方案。氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）以其优异的生物相容性、亲水性和免疫调节功能，在组织工程领域展现出了巨大的潜力。研究表明，氧化石墨烯具有较强的亲水性，可以促进细胞的黏附和增殖，为软骨修复提供了新的可能性。其优异的生物相容性使其与软骨组织形成稳固界面，显著增强了植入物与软骨组织的结合。免疫调节功能可以通过抑制局部炎症反应，有助于软骨缺损修复。因此，氧化石墨烯凭借其多重功能为软骨组织工程的发展提供了一种潜在的策略。 目的：本课题以β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）和聚乙二醇二丙烯酸酯（Polyethylene glycol diacrylate，PEGDA）为框架材料，加入适宜比例的氧化石墨烯，制备成具有免疫调节功能的GO/β-TCP/PEGDA支架（GTP）。研究内容包括：（1）GTP支架的表征研究。（2）评估GTP支架的生物相容性。（3）通过体内实验评估其在修复兔膝关节软骨缺损方面的效果。（4）通过体外实验评估该支架的免疫调节作用，以及促进干细胞募集并促进其分化成软骨细胞，从而实现软骨缺损修复的能力。 材料和方法：（1）支架的制备和表征：首先将适宜比例的氧化石墨烯（GO）粉末加入到含有20 wt%的β-磷酸三钙（β-TCP）/二甲基丙烯酸甲酯（PEGDA）光固化浆料中，利用光固化打印机制制备支架后，对支架进行了多方面的表征研究，包括使用扫描电子显微镜（SEM）、能谱仪（EDS）、原子力显微镜（AFM）等进行分析，同时还进行了水接触角实验和力学性能测试。（2）支架生物相容性：通过使用CCK8、活/死染色、细胞骨架染色和HE染色，评估支架的生物相容性。（3）体内软骨修复：在兔子的膝关节股骨髁间构建了5 mm软骨缺损模型，并以此进行了微骨折术，分别植入了TP和GTP支架。并进一步利用苏木素-伊红染色（HE）、番红固绿染色、免疫组织化学染色和杨氏模量评估该支架在体内修复软骨缺损的效果。（4）体外软骨修复的免疫机制探究：通过聚合酶链反应（PCR）、流式细胞术（FCM）、细胞迁移实验、蛋白质免疫印迹（WB）、阿利新蓝染色及番红O染色实验，评估该支架促进成软骨诱导的能力。 结果：（1）当GO浓度≤0.1μg/mL时，能够促进细胞增殖，并根据这一浓度制备了GO/β-TCP/PEGDA支架（GTP），发现GTP支架具有多孔结构，并在其中检测到C、O、P和Ca等多种元素。TP和GTP支架的水接触角分别为68.51 ± 6.13°和52.19 ± 4.58°。接下来测定TP和GTP支架的压缩模量分别为1.91 ± 0.23MPa和1.79 ± 0.56 MPa。最后测定TP和GTP支架的表面粗糙度分别为66.327 ± 2.855 nm和27.476 ± 4.125 nm。（2）与对照组和TP组相比，GTP组对于骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖无明显影响，并且GTP支架对兔的心脏、肝脏、脾脏、肺部和肾脏的病理变化无明显影响。（3）与TP组和对照组相比，GTP组有更多的糖胺聚糖（GAG）含量和软骨组织的修复，并且GTP组修复的软骨中Ⅱ型胶原的表达更高。GTP组修复软骨的杨氏模量高于TP组和MF组。（4）与TP支架和对照组相比， GTP支架下调了巨噬细胞M1表型iNOS和TLR4的表达，上调了M2表型Arg1和CD206的表达。并且GTP组M2表型的巨噬细胞比例升高。随后，通过Transwell共培养巨噬细胞和BMSCs，与TP和对照组相比，GTP支架促进了BMSCs的迁移。进一步的软骨相关基因检测显示：GTP支架上调了SOX9、Aggrecan和Col2α1的表达，同时有效促进了BMSCs向软骨细胞的分化。 结论：（ 1 ）我们成功通过 3D 打印技术成功制备了GO/β-TCP/PEGDA支架。发现GTP支架具有多孔结构，良好的亲水性和力学强度，并且表面光滑。（2）GTP支架表现出良好的生物相容性。（3）体内实验显示GTP支架能更好地促进兔膝关节软骨缺损的修复。（4）体外实验显示GTP支架可通过免疫调节进而募集骨髓间充质干细胞并促进其成软骨分化，本研究对临床关节软骨缺损修复提供了启发。
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