摘要
工业大麻(Cannabis sativa L.)多为雌雄异株，雌雄性别约1∶1,被广泛用于生产纤维、大麻素、种子和油。研究表明工业大麻雄株纤维品质优于雌株，提高雄株比例有利于工业大麻优质纤维的生产。工业大麻雄性发育相关基因的挖掘与鉴定，可为通过分子手段改变雌雄比例提供基因资源。本研究以工业大麻雌雄异株云麻7号(Y7)为研究对象，对雌雄蕊不同组织进行转录组测序，通过KEGG富集分析，筛选出工业大麻雄蕊发育相关候选基因，并进一步构建过表达载体验证其功能，为工业大麻雄性发育机制的探究及分子改良工业大麻的雌雄比例以提高纤维品种提供了理论基础。主要结果如下: (1)在本实验中，以工业大麻‘Y7’雌蕊(female)和雄蕊(male)为材料，进行RNA-Seq分析，共鉴定出了 8324个显著差异基因。其中，雄蕊中上调基因共5120个，下调基因共3204个。上调基因GO富集主要为细胞壁修饰(Cell wall modification)、果胶分解代谢过程(Pectin catabolic process)、半乳糖醛酸代谢过程(Galacturonan metabolic process)等代谢通路。下调基因GO富集主要为激素介导的信号通路(Hormone-mediated signaling pathway)、生长素激活的信号通路(Auxin-activated signaling pathway)、解剖结构发育(Anatomical structure development)等通路。上调基因KEGG富集主要为氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)、糖酵解/糖异生(Glycolysis/Gluconeogenesis)等代谢通路。下调基因KEGG富集主要为植物激素信号转导(Plant hormone signal transduction)、类黄酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)等代谢通路。GO和KEGG富集分析发现，植物激素信号通路被显著富集。对植物激素信号传导途径相关基因进行相关性分析，CsIAA1(生长素响应基因)基因位于互作网络的中心，且组织特异性表达分析发现CsIAA1基因在雄蕊表达中最低，推测CsIAA1基因在工业大麻雄性发育中有较为重要的作用。 (2)在本研究中，通过对CsIAA1的CDS区进行分析，发现其含有Aux_IAA superfamily结构域，属于Aux/IAA基因家族成员。经过对CsIAA1的氨基酸序列分析发现，存在核定位信号，构建了 PBI121-CsIAA1-GFP融合蛋白，并进行亚细胞定位分析，证明了其是核定位蛋白。通过分析不同雄蕊发育阶段中CsIAA1发现，随着雄蕊的发育，CsIAA1基因表达逐渐下调，表明其可能负调控雄蕊发育。对CsIAA1启动子序列分析发现，含生长素响应元件，且通过外源喷施生长素，CsIAA1基因可在0.5 h被快速诱导。 (3)拟南芥中构建过表达载体PBI121-CsIAA1-GFP,成功获得3个阳性株系。对过表达株系生殖生长和营养生长进行统计学分析发现，与野生型相比，转基因拟南芥表现出植株花粉活力弱、开花期晚、株高变矮、莲座叶少等表型特征。对开花关键基因CO、FT、LEAFY和FLC进行表达量分析发现，转基因植株CO、FT、LEAFY基因表达显著下调。进一步研究发现，转基因拟南芥中JAV1和JAM1表达量显著下调。 本研究通过转录组测序发现，差异表达基因主要富集在植物激素信号转导、苯丙烷生物合成等途径。通过基因共表达网络分析筛选到一个工业大麻雄蕊发育重要基因CsIAA1,利用转基因手段开展雄蕊发育机制的初步研究。通过构建过表达载体发现，CsIAA1-OE是由于影响了 JA信号转导基因和分解代谢基因的表达，进而影响了拟南芥雄蕊的正常发育，降低了花粉的育性。
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